[發明專利]一種多種抗原特異性T細胞體外高效擴增方法

在審

• 申請號: 202210615659.2
• 申請日: 2022-06-01
• 公開（公告）號: CN114934015A
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發明（設計）人: 葉永清;黃能平;王力;左鵬舉;伊莉莉;仇宇光
• 申請（專利權）人: 廈門三一造血技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/0784
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種多種抗原特異性T細胞體外高效擴增方法，屬于細胞基因治療領域，其特征在于使用IL?1β、IL?4、IL?7、IL?15、1L?18、IL?21多種細胞因子組合以及胎盤混合抗原多肽刺激可以在體外獲得多于15種混合CD8+以及CD4+特異性T細胞，其中獲得CD8+T細胞比例25?60%，獲得CD4+T比例在32?55%，使用該種方法獲得的混合腫瘤抗原特異性T細胞為提高腫瘤治療的效果提供一個可能的路徑。

技術領域

一種多種抗原特異性T細胞體外高效擴增方法，屬于細胞基因治療領域。

背景技術

樹突狀細胞（Dendritic Cells,DCs）作為專職抗原呈遞細胞（Antigenpresenting Cells,APC），能攝取、加工及呈遞抗原，處于啟動、調控、并維持免疫應答的中心環節。體外誘導DC細胞是將人外周血單核細胞在體外用多種細胞因子如抗GM-CSF、IL-4、等共同培養，再使用TNFα等因子激發DC細胞逐漸成熟，表達CD80\CD83\CD86分子,通過皮下、淋巴結注射進入病人體內，成熟DC細胞將抗原信息呈遞給T細胞，通常情況下，體內表達某一特異性TCR的T細胞克隆僅占總T細胞庫的1/10⁴~1/10⁵。數量極少的特異性T細胞僅在被抗原激活后，通過克隆擴增而產生大量效應細胞，才能有效發揮作用。體外獲得大量包含CD4+及CD8+腫瘤抗原特異性T淋巴細胞對于基礎研究和臨床細胞治療都十分重要。

抗原特異性細胞毒性T細胞（CD8+ antigen specific CTL細胞）能識別帶特異性抗原的靶細胞，并通過分泌穿孔素，顆粒酶，腫瘤壞死因子的途徑殺傷靶細胞，因此在抗病毒感染、同種異體移植排斥反應和抗腫瘤免疫中起重要作用。通常情況下，體內表達某一特異性TCR的T細胞克隆僅占總T細胞庫的1/10⁴~1/10⁵。體外獲得大量腫瘤抗原特異性T淋巴細胞對于基礎研究和臨床細胞治療都十分重要。輔助性T細胞（CD4+ T細胞）是人體免疫系統中一種重要的免疫細胞，初始CD4+T 細胞接受抗原刺激后，在不同的條件下可分化成不同亞型的T 細胞，執行不同的功能。其分化方向受抗原的性質、局部環境中的激素及細胞因子等多種因素的調控，其中細胞因子的種類和細胞因子之間的平衡對T h 細胞的分化具有重要的調節作用。初始CD4+T細胞在IL-12和γ干擾素(interferon-g, IFN-γ)的誘導下分化為Th1細胞，分泌IFN-γ，參與細胞介導的免疫應答；在IL-4 的誘導下分化為Th2細胞，分泌IL-4、IL-5和IL-13，參與體液免疫應答。

胎盤是一種具有已知壽命的血管器官，它僅隨著懷孕的發生而發展，孕期支持胎兒的生長和發育，孕期結束后可以自發從母體剝離。長期以來，胎盤與腫瘤的共性受到科學家的關注，比如胎盤和腫瘤在侵襲性，血供的豐富程度，細胞類型和生長行為，蛋白組學以及基因組學方面具有很大的相似性，但胎盤與腫瘤最大的不一樣是在孕期結束后可以停止生長，自發從母體剝離，這種現象為腫瘤的治療提供了一個全新的思路。研究表明，胎盤中含有多種的腫瘤相關抗原，可以為臨床治療豐富的腫瘤抗原肽，胎盤來源的多肽可以作為腫瘤預防性及治療性疫苗。

目前用于臨床研究使用的抗原特異性T細胞一般使用CD3 及CD28的單克隆抗體培養獲得CD8+特異性T細胞為主，忽視CD4抗原特異性T細胞在其中的作用。此外，目前用于DC的抗原肽多為體外合成，可能并不能代表抗原在體內的天然構象，以上因素限制了腫瘤抗原特異性T細胞用于臨床治療的效果。

發明內容

本發明提供一種多種抗原特異性T細胞體外高效擴增方法，屬于細胞基因治療領域，其特征在于使用IL-1β、IL-4、IL-7、IL-15、1L-18、IL-21多種細胞因子組合以及胎盤抗原肽刺激可以在體外獲得多于15種混合CD8+以及CD4+特異性T細胞，其中獲得CD8+T細胞比例25-60%，獲得CD4+T比例在32-55%，使用該種方法獲得的混合腫瘤抗原特異性T細胞為提高腫瘤治療的效果提供一個可能的路徑。其通過以下方法制得：