[發明專利]一種NMDAR NR1亞基、NMDAR的突變體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202210607540.0
• 申請日: 2022-05-31
• 公開（公告）號: CN114957445B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發明（設計）人: 李科;趙子越;閆亞平;程靜美;郝文斌;封雪
• 申請（專利權）人: 陜西脈元生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/705
• 分類號: C07K14/705;C12N15/12;C12N15/11;C12N15/10;C12N15/85;C12Q1/6883;A61K38/17;A61P25/00;A61P25/08;A61P25/28
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 蘇士瑩

1.一種NMDARNR1亞基的突變體，其特征在于，所述突變體不識別抗NMDAR腦炎患者的自身抗體；

所述突變體缺失NMDARNR1亞基編碼氨基酸序列的837-838位和864-937位；

所述NMDARNR1亞基的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種構建權利要求1所述突變體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列為模板，利用864-937-F和864-937-R進行PCR擴增，得缺失864-937位氨基酸的NRI亞基突變體；所述864-937-F的核苷酸序列如SEQ?IDNO.6所示，所述864-937-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示；

(2)以所述缺失864-937位氨基酸的NRI亞基突變體為模板，利用837-838-F和837-838-R進行PCR擴增，得缺失837～838位和864-937位氨基酸的NMDARNR1亞基的突變體；所述837-838-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，所述837-838-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。

3.根據權利要求2所述方法，其特征在于，步驟(1)和步驟(2)所述PCR擴增的體系均以50μL計，包括：模板50ng、引物F2μL、引物R2μL、FastPfuDNAPolymerase1μL、5×FastPfubuffer10μL、2.5mMdNTP4μL、DMSO1μL和余量的無核酸酶水；

步驟(1)和步驟(2)所述PCR擴增的程序，均包括：98℃預變性2min；98℃變性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，33個循環；72℃再延伸8min。

4.一種構建NMDAR突變體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將權利要求1所述突變體插入真核表達載體上，得NR1重組載體；

(2)將NMDAR的NR2亞基插入真核表達載體上，得NR2重組載體；

(3)將NR1重組載體和NR2重組載體共同轉染真核細胞，得NMDAR突變體；

步驟(1)和步驟(2)不存在時間上的先后順序。

5.根據權利要求4所述方法，其特征在于，步驟(1)和步驟(2)所述真核表達載體相同。

6.根據權利要求4所述方法，其特征在于，步驟(2)所述NR2亞基包括NR2a或NR2b，所述NR2a的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述NR2b的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

7.根據權利要求4所述方法，其特征在于，步驟(3)所述共同轉染時，所述NR1重組載體和NR2重組載體的質量比為(1:1)～(1:4)。