[發明專利]新月彎孢霉甾體C14α-羥化酶CYP5103B5突變體構建及其應用

在審

• 申請號: 202210604268.0
• 申請日: 2022-05-31
• 公開（公告）號: CN114958787A
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 劉曉光;喬江羽;路福平;毛淑紅;王碩
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/81;C12N1/19;C12P33/06;C12R1/865
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本發明專利提供了新月彎孢霉甾體C14α?羥化酶突變體Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6所示。同C14α?羥化酶CYP5103B5相比，突變體Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G轉化甾體底物孕酮的特異性明顯提高，副產物明顯減少。本發明專利還提供了涉及CYP5103B5突變體異源過表達的表達載體及其甾體轉化工藝，為研究開發高效孕酮C14α?羥化生產工藝提供了寶貴材料(基因和菌種)和基礎數據支撐。

技術領域：

本發明應用基因工程和酶工程技術，具體涉及C14α-羥化酶突變體及其應用。

背景技術：

甾體激素類藥物被廣泛應用于臨床治療。該類藥物主要用于抗病毒、消炎、抗腫瘤、抗癌細胞活性、免疫調節、抗過敏、避孕、治療心腦血管疾病以及促進骨骼發育等方面。甾體化合物的結構復雜，其生理及藥理活性取決于甾體母核特定位點的取代基。

14α-羥基化反應是一個非常重要的過程，14α-羥基甾體化合物具有抗癌生物活性和特殊的促性腺激素作用。例如孕酮的14α-羥基衍生物14α-羥基-孕甾-4-烯-3，20-二酮可以作為替代化學合成途徑的藥物前體，生成一種廣泛應用于獸用避孕及治療的高活性抗促性腺激素藥物普羅孕酮的前體；雄烯二酮(AD)的14α-羥基衍生物14α-羥基-4-烯-3，17-二酮，可以作為合成14α-羥基-4-烯-3，6，17-三酮的前體，且14α-羥基-4-烯-3，6，17-三酮被證明能夠抑制人體胎盤和子宮腫瘤的芳香酶活性和雌激素的合成，并可用于乳腺癌或雌激素依賴性子宮腫瘤的化療。除了用于抗炎及避孕外，其中幾種14α-羥基甾體化合物還表現出抗腫瘤活性。除此之外，14α-羥基構型可以轉化為有心臟活性類固醇結構特征的14β-構型，14β-羥基甾體化合物的衍生物是重要的心肌收縮增強劑。據報道，14-OH-5β，14β-孕甾烷的C-3糖苷衍生物已被證明與心肌的糖苷受體會產生強烈的相互作用。

盡管14α-羥基甾體化合物有許多生物活性，但合成14α-羥基甾體衍生物的方式有限。由于甾體母核C14三級結構位置的特殊性，使得利用化學合成的方法很難在該位置引入羥基，但甾體微生物轉化能夠通過一步將氧原子插入甾體分子的遠程非活化的C-H鍵，且具有極好的區域和立體選擇性，為工業生產有價值的中間體提供了有效的解決方案。絲狀真菌是甾體選擇性羥基化商業菌株的主要來源。利用新月彎孢霉雖然可以在孕酮的C14α位引入羥基，但它無法進一步積累14α-羥基孕酮，并且使用新月彎孢霉存在一些潛在的應用缺陷。一方面，新月彎孢霉生長緩慢，產孢量較弱，液體培養時很難控制其形態同質性。另一方面，新月彎曲霉構成了潛在的安全風險，因為據報道，這種真菌可能會在人類中引起幾種類型的感染，如角膜炎和皮膚病。相比之下，釀酒酵母以其自然優勢而聞名，如快速生長、成熟的基因操作和使用安全。因此，我們克隆鑒定了新月彎孢霉CICC40301中的C14α-羥化酶基因CYP5103B5。C14α-羥化酶CYP5103B5雖然可以轉化孕酮但它無法進一步積累14α-羥基孕酮。

為了改善新月彎孢霉C14α-羥化酶CYP5103B5基因對底物孕酮的羥化特異性，利用定點突變技術對其進行分子水平上的改造，篩選獲得了兩個對孕酮具有高羥化特異性C14α-羥化酶突變體Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V1331/R134K/S135K)、D131G。發酵轉化結果顯示，過表達突變體Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G的重組釀酒酵母對底物孕酮的C14α-羥化特異性明顯提高，為研究開發綠色高效孕酮C14α-羥化工藝奠定了堅實的基礎。

發明內容：

針對現有甾體孕酮羥化產物特異性不高的現狀，本發明的第一個目標是利用分子操作技術構建重組表達載體，在釀酒酵母中進行異源表達，篩選出C14α-高羥化特異性的突變體Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G。