[發明專利]一種利用CRISPR/Cas12a體系可視化檢測杭白菊葉枯病球毛殼菌的方法

在審

• 申請號: 202210601319.4
• 申請日: 2022-05-30
• 公開（公告）號: CN114836570A
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 宋陽;申屠旭萍;劉妍;俞曉平
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

本發明提供了一種利用CRISPR/Cas12a體系可視化檢測杭白菊球毛殼菌C.globosum的方法，包括如下步驟：借助PCR技術對杭白菊球毛殼菌C.globosum特異性基因片段進行擴增；在crRNA的介導下，Cas12a特異性識別擴增產物，并激活核酸酶活性，從而切割兩端修飾有FAM和BHQ1的任意堿基序列ssDNA(Reporter)，形成FAM?ssDNA片段與BHQ1?ssDNA片段；FAM?ssDNA和BHQ1?ssDNA能在藍光透射儀的照射下展現出熒光，由此實現對于杭白菊球毛殼菌C.globosum的檢測。該方法操作簡單便攜，不依賴大型儀器設備，成本低廉，且靈敏度高、特異性強，具有一定的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物與化學領域，涉及一種利用CRISPR/Cas12a體系可視化檢測杭白菊葉枯病球毛殼菌Chaetomium globosum(C.globosum，Cg)的方法。

背景技術

規律成簇的間隔短回文重復序列(CRISPR，Clustered regularly interspacedshortpalindromic repeats)是許多細菌和古細菌中的一種應對入侵的免疫機制。CRISPR及CRISPR相關蛋白(CRISPR associated proteins,Cas)被稱為CRISPR/Cas系統。Cas12a為第2類V型Cas蛋白，它在未激活時無切割活性，當其與特定的crRNA結合后，Cas12a構象將發生改變，與crRNA結合形成Cas12a-crRNA二元復合物。該復合物能特異性得識別靶標DNA，并激活其核酸內切酶活性。當Cas12a依次對DNA雙鏈進行順式切割后，該活性位點將持續暴露，展現出反式切割活性，對周圍的ssDNA進行非特異性切割。針對Cas12a的特性，科學家們設計了多種高靈敏度、高特異性的核酸檢測平臺。

杭白菊(Chrysanthemum morifolium Ramat)為菊科菊屬，是我國傳統的藥用栽培植物和浙江省八大藥材“浙八味”之一。目前浙江杭白菊常年種植面積7萬畝，年均總產值超過1億元，約占全國菊花總銷量的50％。現代藥理研究表明其具有消炎、抗氧化、抗癌，舒血管、降血脂、改善腸道微環境等多種功效。而葉枯病是杭白菊主要的葉片病害，病葉初期先變黃，黃色部分逐漸變褐色壞死。由局部擴展到整個葉脈，呈現褐色至紅褐色的葉緣病斑，病斑邊緣波狀，顏色較深。病健交界明顯，其外緣有時還有寬窄不等的黃色淺帶，隨后，病斑逐漸向葉基部延伸，直至整個葉片變為褐色至灰褐色。葉枯病的產生嚴重影響了農產品的經濟效益。然而，傳統的分離鑒定法檢驗周期較長，操作步驟繁復，耗時費力，難以滿足田間的便捷檢測的需求，因此，克服傳統分離鑒定方法的局限，引入前沿技術，開發出準確、快速、便捷、靈敏、特異的杭白菊葉枯病球毛殼菌C.globosum菌檢測技術具有重大意義。

現階段杭白菊葉枯病球毛殼菌C.globosum的檢測技術主要依賴分子生物學或免疫學檢測的方法。分子生物學依靠對目的基因ITS序列進行擴增，然后通過進化樹分析確定物種信息。整個過程需要7-10天的時間，無法進行快速檢測。或者通過熒光定量PCR的方法確定特異性基因的表達水平，但該類檢測方法對儀器和檢測人員的技術要求較高，同時需要昂貴的實驗設備，難以實現現場即時檢測；免疫學用兩個特異性探針分別對自然感染白葉枯菌和條斑菌的葉片M1N提取液和種子浸泡液進行實時熒光GHI，此類檢測方法檢測雖然特異性好，但靈敏度較低，耗時較長，成本較高，因此并不適用于基層大批量檢測。

發明內容

本發明的目的在于克服傳統葉枯病球毛殼菌C.globosum檢測的技術缺陷，以特異性基因片段為檢測目標，提供一種簡單、快速、靈敏、特異、便攜的檢測方法。

為此，本發明采用的技術方案如下：

利用CRISPR/Cas12a體系可視化檢測杭白菊葉枯病球毛殼菌C.globosum的方法，其包括如下步驟：

步驟一：對杭白菊葉枯病球毛殼菌C.globosum基因組中的特異性目的基因片段進行PCR擴增；

PCR擴增所用引物序列包括：