[發明專利]一種利用CRISPR/Cas12a體系可視化檢測杭白菊葉枯病球毛殼菌的方法

在審

• 申請號: 202210601319.4
• 申請日: 2022-05-30
• 公開（公告）號: CN114836570A
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 宋陽;申屠旭萍;劉妍;俞曉平
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

1.利用CRISPR/Cas12a體系可視化檢測杭白菊葉枯病球毛殼菌C.globosum的方法，其特征在于包括如下步驟：

步驟一：對杭白菊葉枯病球毛殼菌C.globosum基因組中的特異性目的基因片段進行PCR擴增；

PCR擴增所用引物序列包括：

C.g-PCR-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

C.g-PCR-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

步驟二：將擴增的PCR產物加入含CRISPR/Cas體系的反應管中，孵育，所述的CRISPR/Cas體系包括針對目的基因的特異性crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和用于酶標儀熒光檢測的reporter序列，crRNA序列如SEQ ID No.3所示；在crRNA的介導下，CRISPR/Cas12a蛋白特異性識別特異性基因片段的擴增片段，并激活核酸酶活性，從而切割兩端修飾有FAM和BHQ1的reporter序列形成FAM-ssDNA與BHQ1-ssDNA；

步驟三：FAM-ssDNA與BHQ1-ssDNA在藍光投射儀下顯現出熒光，實現對于杭白菊葉枯病球毛殼菌C.globosum的可視化檢測。

2.如權利要求1所述的CRISPR/Cas12a體系可視化檢測球毛殼菌C.globosum的方法，其特征在于：步驟一中，PCR步驟為：95℃預變性3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共循環30次；后72℃延伸10min。

3.如權利要求1所述的CRISPR/Cas12a體系可視化檢測球毛殼菌C.globosum的方法，其特征在于：步驟二中，孵育溫度為37℃，孵育時間為30min。

4.如權利要求1所述的利用CRISPR/Cas12a體系可視化檢測杭白菊葉枯病球毛殼菌C.globosum的方法，其特征在于：所述reporter序列為用于酶標儀熒光檢測的ssDNA FQreporter，其序列如下：5’-FAM-NNNNN-BHQ1-3’，NNNNN指任意堿基序列。

5.如權利要求1所述的利用CRISPR/Cas12a體系可視化檢測球毛殼菌C.globosum的方法，其特征在于：步驟二中，Cas12a濃度為100nM，Cas12a與crRNA的濃度比為1:1-1:5，Reporter序列的濃度為250-2000nM。

6.如權利要求1所述的CRISPR/Cas12a體系可視化檢測球毛殼菌C.globosum的方法，其特征在于：步驟二中，CRISPR/Cas12a體系的反應溫度為35-40℃，反應時間為10-90min。

7.如權利要求1所述的CRISPR/Cas12a體系可視化檢測球毛殼菌C.globosum的方法，其特征在于步驟三中，反應管直接于藍光透射儀的照射下展現出熒光，實現對于杭白菊葉枯病球毛殼菌C.globosum的可視化檢測。