[發明專利]耐乙醇片球菌及其活化方法、菌劑及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202210598849.8
• 申請日: 2022-05-30
• 公開（公告）號: CN114752539B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發明（設計）人: 高鴻;李雨萌;吳艷萍;鐘凱;黃毅娜
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/04;A23L29/00;A23L19/20;C12R1/01
• 代理公司: 成都欣圣知識產權代理有限公司 51292
• 代理人: 王海文

本發明公開了一種耐乙醇片球菌及其活化方法、菌劑及其制備方法和應用，該耐乙醇片球菌（Pediococcus ethanolidurans）M1117保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC No.M 2022210。該耐乙醇片球菌M1117采用MRS培養基，于30~45℃條件下培養活化，其活性較好且生長較快，可制作發酵直投式菌劑。該菌劑為耐乙醇片球菌M1117的菌體與凍干保護劑通過真空冷凍干燥制得，能應用于泡菜的制備。泡菜的制備方法是以辣椒為原料，添加輔料，并接種菌劑，進行密封發酵，得到低亞硝酸鹽泡菜。該方法改善了泡菜的色澤和風味，縮短了發酵時間，發酵過程中亞硝酸鹽含量均低于2mg/Kg，提高了泡菜食用的安全性。

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，特別涉及一種耐乙醇片球菌及其活化方法、菌劑及其制備方法和應用。

背景技術

泡菜是一種傳統的發酵蔬菜制品，泡菜以新鮮蔬菜等為主要原料，添加或不添加輔料，經食用鹽或食用鹽水泡漬，在厭氧條件下通過附著在蔬菜表面的乳酸菌發酵，調味或不調味等工藝加工而成的蔬菜制品。經過發酵作用，不僅可以保留蔬菜本身的營養物質，而且使其更具有獨特的風味。泡菜不僅能夠提高人們的食欲，還能在發酵的過程中產生對人體有益的乳酸菌，抑制腸道中腐敗菌的生長，促進人體的消化。

但是，泡菜在腌制過程中會產生對人體健康不利的亞硝酸鹽，他們主要來自于蔬菜中含量較高的硝酸鹽。蔬菜吸收氮肥或土壤中的氮素，積累無毒的硝酸鹽，在腌制過程中硝酸鹽被一些亞硝酸鹽還原細菌轉變成亞硝酸鹽，從而產生毒性。泡菜中亞硝酸鹽的危害主要有：（1）亞硝酸鹽進入血液后可與血紅蛋白結合，使血紅蛋白氧化變為高鐵血紅蛋白，從而失去攜氧能力，導致組織缺氧；（2）亞硝酸鹽極易與胺合成N-亞硝胺，亞硝胺是一種致癌物質。因此在泡菜的腌制過程中如果產生過多亞硝酸鹽會不利于人們的健康，存在食品安全問題。所以找到一種有效降低泡菜中亞硝酸鹽含量的方法至關重要。

傳統泡菜依靠蔬菜原料表面的微生物在自然條件下發酵而成，但自然發酵泡菜中微生物種類復雜多樣，泡菜質量不穩定難以進行工業化生產。目前市場上對泡菜發酵劑的需求越來越高，利用發酵劑可以縮短發酵周期，獲得較為穩定的質量。泡菜中的優勢菌種在發酵過程中發揮了主導作用，利用優勢菌種作為發酵劑制備風味優良的泡菜，是當前市場需求的趨勢所在。

發明內容

基于此，本申請從川南傳統洞藏泡菜水中分離出來一種菌株，經分子生物學、系統進化分析和形態學分析鑒定為耐乙醇片球菌，命名為Pediococcus ethanoliduransM1117，其16S rRNA序列已存入NCBI數據庫，GenBank登錄號為ON102795，該菌種于2022年3月7日保藏在中國典型培養物保藏中心（CCTCC），詳細地址為湖北省武漢市武昌區八一路珞珈山，保藏編號為CCTCC No. M 2022210。

本申請還提供了一種所述耐乙醇片球菌M1117的活化方法，包括以下步驟：

步驟S1. 將耐乙醇片球菌M1117采用劃線法，在MRS瓊脂固體培養基上接種，并在30~45℃條件下，于恒溫培養箱中培養36~48h，獲得單菌落；

步驟S2. 將單菌落接種在MRS肉湯培養基中，于30~45℃、100~220r/min條件下，振蕩培養18~36h，活化，得到耐乙醇片球菌M1117培養液。

本申請還提供了一種菌劑，所述菌劑包含所述的耐乙醇片球菌M1117。

本申請還提供了所述菌劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟S1. 將耐乙醇片球菌M1117培養液在 6000~15000 r/min、4℃條件下，離心10~20 min，棄上清液，收集菌體；

步驟S2. 在菌體中加入凍干保護劑，混合均勻，置于-25~-15℃預凍10~24h，然后真空冷凍干燥，得到直投式菌劑。