[發(fā)明專利]一種能在黑曲霉細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的復(fù)制子

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210598320.6
• 申請(qǐng)日: 2022-05-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114958899A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-08-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林峻;燕天鶴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/80
• 分類號(hào): C12N15/80;C12N15/67;C12N15/68;C12R1/685
• 代理公司: 福州君誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

本發(fā)明公開(kāi)了一種能在黑曲霉細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的復(fù)制子，所述復(fù)制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述復(fù)制子是以19種真菌基因組為模板構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，轉(zhuǎn)化黑曲霉孢子篩選得到，所述復(fù)制子來(lái)自淡紫色擬青霉基因組。本發(fā)明的復(fù)制子可以在黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)中發(fā)揮復(fù)制功能，并且可以提供比AMA1復(fù)制子更高的穩(wěn)定性，為首次在除構(gòu)巢曲霉以外的真菌中發(fā)現(xiàn)的復(fù)制子，豐富了復(fù)制子元件庫(kù)，拓展了絲狀真菌利用復(fù)制子的選擇多樣性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能在黑曲霉細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的復(fù)制 子。

背景技術(shù)

在真菌自主復(fù)制序列未被發(fā)現(xiàn)之前，絲狀真菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)最主要的缺陷是沒(méi)有 類似于可以在酵母菌染色體外自主復(fù)制的質(zhì)粒，導(dǎo)致整合轉(zhuǎn)化的效率低下。自研 究人員在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)ARS序列以來(lái)，關(guān)于復(fù)制子的研究在真菌中展開(kāi)，最 早在構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn)一段6.1Kb的序列AMA1，含有AMA1序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化構(gòu) 巢曲霉可以將轉(zhuǎn)化效率提高250倍，并且可以在染色體外自主復(fù)制，該序列也被 應(yīng)用于其他真菌，如產(chǎn)黃青霉、黑曲霉、寄生曲霉等。從1991年AMA1序列發(fā) 現(xiàn)至今，有關(guān)絲狀真菌的自主復(fù)制序列研究進(jìn)展緩慢，因此篩選潛在的真菌復(fù)制 子可為合成生物學(xué)的發(fā)展提供一定的參考價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種能在黑曲霉細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的復(fù)制子R75flank3.405，所述復(fù)制子是以19種真菌基因組為模板構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，轉(zhuǎn) 化黑曲霉孢子篩選得到，所述復(fù)制子來(lái)自淡紫色擬青霉基因組。

本發(fā)明提供的能在黑曲霉細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的復(fù)制子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

所述復(fù)制子R75flank3.405的構(gòu)建方法如下：

1)以AnEp8-AnHyg質(zhì)粒為模板，經(jīng)Not I酶切除去AMA1復(fù)制子得到 AnEp8-AnHyg-deleteAMA1載體；以19種真菌混合基因組為模板，經(jīng)Tn5建庫(kù)試 劑盒進(jìn)行DNA片段化處理，Altama-F/R引物擴(kuò)增篩選4-5Kb目的片段，將擴(kuò)增產(chǎn) 物回收并純化；將AnEp8-AnHyg-deleteAMA1線性載體與目的片段使用In-fusion 法連接并轉(zhuǎn)化至10β超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒備用；

2)利用HDEN技術(shù)將步驟1)得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至黑曲霉孢子，Hyg抗性基因 篩選到一個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，以所述陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子孢子為模板，Not I-F/R引物驗(yàn)證， sanger測(cè)序得到一段R75序列，包含部分核糖體大亞基蛋白L9和DNA復(fù)制解旋酶 序列；

3)以19種真菌基因組為模板，R75-F/R引物擴(kuò)增得出R75序列來(lái)源，以R75 序列來(lái)源為模板，R75flank-F/R擴(kuò)增得到R75flank3.405片段，與步驟1)中的 AnEp8-AnHyg-deleteAMA1連接得到AnEp8-R75flank3.405質(zhì)粒。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的R75flank3.405復(fù)制子可以在黑曲霉表達(dá) 系統(tǒng)中發(fā)揮復(fù)制功能，并且可以提供比AMA1復(fù)制子更高的穩(wěn)定性，為首次在 除構(gòu)巢曲霉以外的真菌中發(fā)現(xiàn)的復(fù)制子，豐富了復(fù)制子元件庫(kù)，拓展了絲狀真菌 利用復(fù)制子的選擇多樣性。

附圖說(shuō)明

圖1是不同擴(kuò)增循環(huán)數(shù)、Tn5用量以及處理時(shí)間對(duì)目的片段的影響；

M：Takara 250bp DNA Ladder Marker；(A)泳道1-5：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)分別為 15、20、25、30、35；(B)泳道1-2：Tn5用量分別為0.05U和0.03U；(C)泳 道1-5：片段化處理時(shí)間分別為10sec、15sec、20sec、25sec、30sec。

圖2是Tn5文庫(kù)菌落PCR驗(yàn)證。

圖3是Tn5文庫(kù)黑曲霉菌落PCR驗(yàn)證。

圖4是R75序列。