[發明專利]一種能在黑曲霉細胞內自主復制的復制子

在審

• 申請號: 202210598320.6
• 申請日: 2022-05-30
• 公開（公告）號: CN114958899A
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 林峻;燕天鶴
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/67;C12N15/68;C12R1/685
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

1.一種能在黑曲霉細胞內自主復制的復制子，其特征在于，所述復制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如權利要求1所述的一種能在黑曲霉細胞內自主復制的復制子的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）以AnEp8-AnHyg質粒為模板，經Not I酶切除去AMA1復制子得到AnEp8-AnHyg-deleteAMA1載體；以19種真菌混合基因組為模板，經Tn5建庫試劑盒進行DNA片段化處理，Altama-F/R引物擴增篩選4-5 Kb目的片段，將擴增產物回收并純化；將AnEp8-AnHyg-deleteAMA1線性載體與目的片段使用In-fusion法連接并轉化至10β超級感受態細胞，提取質粒備用；

2）利用HDEN技術將步驟1）得到的質粒轉化至黑曲霉孢子，Hyg抗性基因篩選到一個陽性轉化子，以所述陽性轉化子孢子為模板，Not I-F/R引物驗證，sanger測序得到一段R75序列，包含部分核糖體大亞基蛋白L9和DNA復制解旋酶序列；

3）以19種真菌基因組為模板，R75-F/R引物擴增得出R75序列來源，以R75序列來源為模板，R75flank-F/R擴增得到R75flank3.405片段，與步驟1）中的AnEp8-AnHyg-deleteAMA1連接得到AnEp8-R75flank3.405質粒。