[發明專利]氨基化動物源聚糖酶法接枝多肽的制備方法及應用

在審

• 申請號: 202210595452.3
• 申請日: 2022-05-29
• 公開（公告）號: CN114891845A
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發明（設計）人: 黃代勇;徐曙光;黃云琦;盧曉會;劉志格
• 申請（專利權）人: 武漢東方天琪生物工程有限公司
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26;C12P19/14;C12P21/00;C08B37/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.應用酶分子機器技術制備不同分子量(段)動物源聚糖的方法，其特征在于：所述說的動物源聚糖是以不同分子量殼聚糖為糖基時：

⑴酶分子機器技術制備不同分子量(段)殼聚糖混合物的方法，其特征在于：

①使用市售殼聚糖酶來酶解殼聚糖，以生成不同分子量(段)殼聚糖(Chitosan,CS)混合物；

②酶解準備，按底物濃度 12～15%，配制CS溶液，再加入2.0%的醋酸溶液，調節pH，在500L酶解罐中，按有效容量350kg計，酶底比1：10加入β-殼聚糖酶液；

③酶解反應，溫度 45～50℃，pH 4.5～5.5，且隨時調節pH，攪拌40～60r/min，時間：2.5～3.5小時，取樣測定酶解物控制在800～1000 mPa?s)時，停止酶解反應；

④離心分離，用薄板換熱器升溫至130℃，3～5s瞬間滅酶，硅藻土濾機過濾澄清；此時的CS酶解液粘度為600～700 mPa?s(粘度低于剛停止酶解時是因為已去雜)；

⑤采用離子交換裝置脫鹽，為下工序超濾的污染防治創造條件；

⑥前述酶解液的分子量范圍為2～60kDa”，CS轉化率為95%，稱為“中間產物Ⅰ”；

⑵對“中間產物Ⅰ”進行超濾篩分：應用中空纖維超濾膜裝置，設60kDa，40kDa，20kDa，10kDa，6kDa， 2kDa，共6套截留不同分子量的超濾膜組件，在超濾壓力0 .25～0 .30 MPa，待超濾液 pH為 7.5～8.0，溫度為 25～28℃的條件下，對“中間產物Ⅰ”進行超濾；

⑶所述“中間產物Ⅰ”可以篩分出不同分子段的產品，A類產品為殼亞聚糖，分子量＞60kDa，約占超濾產物的5.0%，B類產品為殼次亞聚糖(40～60kDa)，約占超濾產物的10.0%，C類產品為殼次聚糖(20～40kDa)，約占超濾產物的30.0%，D類產品為中分子殼聚糖(10～20kDa)，約占超濾產物的25.0%，E類產品為小分子殼聚糖(殼大糖，6～10kDa)，約占超濾產物的15.0%，F類產品為大分子殼寡糖(2～6kDa)，約占超濾產物的10%，G類產品為小分子殼寡糖(＜2kDa)約占超濾產物的5.0%；將2～60kDa不同分子量(段)的殼聚糖液分別濃縮成含固量24～26%的產品，這些產品統稱為“中間產物Ⅱ”；而＞60kDa的殼聚糖另作他用，＜2kDa的小分子殼寡糖既可單用，也可以使用大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(D75型)從直鏈小分子甘露寡糖中分離出殼六糖和殼五糖，統稱為“中間產物Ⅲ”。

2.應用聲化技術輔助氨解，制備Arg偶聯不同分子量(段)動物源聚糖的方法，其特征還在于，Arg偶聯不同分子量(段)CS：

⑴聲化技術輔助下，經氨解反應制備出Arg偶聯CS(Arg-CS)，不同分子量(段)CS包括但不限于殼亞聚糖，殼次亞聚糖，殼次聚糖、中分子殼聚糖、小分子殼聚糖等；

⑵取100g任意分子量(段)CS分散于1000 ml純水中，加200g Arg，用5%的氨水調節pH至9；再用超聲波裝置于30 MHz、強度40%處理60min，制備出Arg-任意分子量(段)CS；

⑶將Arg-CS溶液置于真空離心機，設定溫度30℃，1400rpm，離心去除少量的游離氨，用2.0%乙酸溶液調節pH至8.0～8.5后備用；

⑷用1kDa分子量超濾膜或納濾膜除去溶液中的游離Arg，反應結束后，以無水乙醇沉淀Arg-CS，再以體積分數為 70％乙醇溶液離心洗滌至上層清液無坂口反應；上述反應結束后測定Arg-CS的偶聯率(Cr)均值為60.0%，電導率均值為280μs/cm(該指標從側面確認了Arg偶聯到了CS糖分子上)，稱為“1＃產物”。