[發明專利]抗H1N1流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體ZJU11-03及其應用

在審

• 申請號: 202210595323.4
• 申請日: 2022-05-28
• 公開（公告）號: CN114891096A
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發明（設計）人: 吳海波;楊帆;吳南屏;姚航平
• 申請（專利權）人: 浙江大學醫學院附屬第一醫院
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N5/20;A61K39/42;A61P31/16
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 朱瑩瑩

本發明提供抗H1N1流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體ZJU11?03及其應用。經純化的H1N1流感病毒血凝素蛋白免疫BALB/C小鼠，收集致敏的BALB/C小鼠B淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，利用酶聯免疫吸附試驗判定陽性克隆，建立分泌抗H1N1流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系ZJU11?03，把陽性的細胞擴增培養并注射至同品系的小鼠腹腔誘導產生含抗體的腹水，經過收集腹水與抗體親和純化，獲得抗H1N1流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體ZJU11?03。抗體的重鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID No.2，輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。對該單克隆抗體進行進一步的理化性狀分析和功能鑒定，建立了以該單克隆抗體為藥物治療H1N1亞型季節性流感病毒感染。本發明為H1N1季節性流感病毒感染的治療提供了有效的工具，并可推廣用于與其他藥物聯合應用以及其他研究。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及抗H1N1流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體的制備及應用，是利用細胞工程、抗體工程技術，獲得分泌抗血凝素蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞系，通過同品系的小鼠誘導腹水，制備抗血凝素蛋白的單克隆抗體ZJU11-03，鑒定為IgG1、κ型，再通過親和純化、電泳、免疫等技術實現對該抗體的應用。

背景技術

2009年6月，世界衛生組織宣布甲型H1N1流感大流行正在進行。隨后這種甲型H1N1流感逐漸轉變為季節性流感，在全球范圍內流行。甲型H1N1流感的早期癥狀與普通流感相似，易被輕視，但病情可迅速進展，突然高熱、肺炎，重者可以出現呼吸衰竭、多器官損傷，甚至死亡，病死率可達6％。目前甲型H1N1流感大流行的防治措施主要是流感疫苗和抗病毒藥物。但是疫苗開發往往滯后于疫情暴發，并且大多數人對甲型H1N1流感病毒沒有免疫力，因此當季節性疫苗與當年的流行毒株不匹配時則可能導致疫苗無效和大流行的發生。另外日益嚴重的耐藥性問題也提示尋求一種新的針對流感的預防和治療干預措施迫在眉睫。作為化學藥物和疫苗的有效補充，單克隆抗體具有高度的特異性、有限的脫靶效應和良好的安全性，由抗體介導的預防和診斷措施已顯現良好的效果，其應用前景得到廣泛認同。

血凝素是流感病毒表面的三聚體糖蛋白，其含有兩個結構域，包括由受體結合位點組成的球狀頭部(易發生抗原漂移)和莖部(在流感病毒的各種病毒株中較為保守)。據研究表明，病毒感染或疫苗接種引起的保護作用主要是通過針對流感HA球狀頭部的中和抗體介導的。這些抗HA頭部抗體通常針對某種亞型具有較強的特異性和有效性，例如單抗5J8、2D1、S-OIV-3B2、2H4和2G2、EM-4C04、KPF、651、CH67對H1N1病毒具有很強的中和作用。而另一些針對HA莖部的抗體通常是廣譜中和抗體，例如抗莖部單克隆抗體A06、C179、3E1、I5-24、 V3-2G6、I8-1B6、V3-1G10、V3-3D2和I4-128可以保護小鼠免受H1和H5流感感染。

基于以上背景，本項目選定血凝素蛋白為靶抗原，采用融合雜交瘤技術建立穩定分泌抗血凝素蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系，并大量制備、純化和鑒定這些單克隆抗體。該單克隆抗體的成功獲得，為治療和預防新型H1N1流感病毒感染提供新思路。

本發明用到雜交瘤細胞技術。該技術將免疫小鼠的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以建立分泌均質抗體的雜交瘤細胞系，也稱為單克隆抗體技術。該技術涉及到動物免疫、細胞培養、細胞融合、細胞克隆培養和免疫測定等一系列方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種抗H1N1流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體，能中和H1N1季節性流感病毒。該單克隆抗體亞型為IgG1、κ型，命名為ZJU11-03，能特異性識別流感病毒的血凝素蛋白，序列如下：

SEQ ID No.1

重鏈:DNA序列(363bp)

Signal sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4