[發明專利]抗H1N1流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體ZJU11-03及其應用

在審

• 申請號: 202210595323.4
• 申請日: 2022-05-28
• 公開（公告）號: CN114891096A
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發明（設計）人: 吳海波;楊帆;吳南屏;姚航平
• 申請（專利權）人: 浙江大學醫學院附屬第一醫院
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N5/20;A61K39/42;A61P31/16
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 朱瑩瑩

1.一種抗H1N1流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體ZJU11-03，該單克隆抗體亞型為IgG1、κ型，能與H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原特異結合，抗體的重鏈可變區氨基酸序列如SEQ IDNo.2，輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.根據權利要求1所述的抗H1N1流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體ZJU11-03，其特征在于：由雜交瘤細胞產生。

3.根據權利要求2所述的抗H1N1流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體ZJU11-03，其特征在于：產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞SP2/0經融合、篩選、克隆、傳代和反復凍存、復蘇后獲得的雜交瘤細胞系ZJU11-03，能穩定分泌抗H1N1流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體ZJU11-03。

4.權利要求1所述的抗H1N1流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體ZJU11-03的制備方法，其特征在于：該單克隆抗體通過的以下步驟獲得：

(1)小鼠免疫：選擇6周齡的BALB/C小鼠，以純化的H1N1流感病毒的血凝素蛋白對小鼠進行免疫；每只小鼠以30微克的抗原蛋白混合佐劑后大腿內側肌肉注射免疫，第21天后再免疫一次，共2次；第3次加強免疫3天后用于融合；

(2)小鼠骨髓瘤細胞的培養：培養小鼠骨髓瘤細胞SP2/0并使其保持良好的生長狀態用于雜交瘤細胞融合；

(3)細胞融合：采用聚乙二醇細胞融合法；以BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養細胞，在融合前一天，接種BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞于96孔培養板，含20％牛血清的次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶培養基培養一天，將步驟(1)中備好的小鼠處死，獲取脾臟淋巴細胞；收集步驟(2)中的SP2/0細胞，將上述兩種細胞混合離心，然后以聚乙二醇介導細胞融合，融合后的細胞適當稀釋，接種至培養板，適當條件培養；

(4)雜交瘤細胞的篩選：將上述培養物在含次黃嘌呤-磷酸核糖轉移酶選擇性培養基中培養；在細胞集落長到大小合適時，吸取培養上清液以酶聯免疫吸附檢測法做抗體鑒定，篩選陽性克??；

(5)雜交瘤細胞的克隆化培養：以有限稀釋法克隆陽性的雜交瘤細胞，將稀釋到一定密度的細胞接種至96孔細胞培養板，使每孔只有一個細胞生長；形成細胞集落的孔取上清做酶聯免疫吸附檢測，篩選和鑒定陽性克隆；可以重復有限稀釋若干次，直到雜交瘤細胞的陽性孔率達到100％；將克隆化后的雜交瘤細胞擴大培養并做抗體理化性狀分析和鑒定；

(6)小鼠腹水的誘生：在接種雜交瘤細胞前1周，給BALB/C小鼠腹腔注射石蠟油每只0.5毫升，然后每只接種生長良好的5×106個陽性雜交瘤細胞，10天后收集腹水離心，測定抗體效價，并純化腹水中的單克隆抗體；

(7)單克隆抗體的純化：利用Protein G親和純化法純化腹水中的單克隆抗體。

5.權利要求1或2所述的抗H1N1流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體ZJU11-03在制備預防H1N1季節性流感病毒藥物中的應用。

6.權利要求1或2所述的抗H1N1流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體ZJU11-03在制備治療H1N1季節性流感病毒藥物中的應用。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于：所述藥物通過病毒中和作用治療H1N1季節性流感病毒感染。