[發明專利]一種基于數字PCR技術檢測耶氏肺孢子菌的試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202210593956.1
• 申請日: 2022-05-27
• 公開（公告）號: CN115029471A
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發明（設計）人: 劉晶;劉秀梅;王澤旭;王亮;王小強
• 申請（專利權）人: 大連干細胞與精準醫學創新研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 周媛媛;李馨

本發明公開了一種基于數字PCR技術檢測耶氏肺孢子菌的試劑盒及檢測方法，屬于病原微生物檢測技術領域。本發明所述試劑盒包括特異性擴增引物、熒光探針、陽性質控品、陰性質控品和檢測試劑，其中，所述特異性擴增引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1～NO.2所示；所述熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述陽性質控品為含有耶式肺孢子菌基因保守區域的重組質粒，保守區域的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本發明所述試劑盒和檢測方法具有靈敏度高、特異性強，可對復雜生物樣本中低豐度的核苷酸進行定性和定量檢測的優點，有助于實現臨床肺孢子菌肺炎的早期、快速、精確定量檢測。

技術領域

本發明屬于病原微生物檢測技術領域，具體涉及一種基于數字PCR技術檢測耶氏肺孢子菌的引物和探針，以及包含該引物和探針的試劑盒及檢測方法。

背景技術

肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia,PCP)是臨床上常見的呼吸道系統疾病，主要發生在免疫功能低下者，如虛弱的早產兒、獲得性免疫缺陷綜合征患者、惡性腫瘤或血液病患者化療后以及長期使用免疫抑制藥物的患者等免疫功能低下的人群。PCP是艾滋病患者最重要的機會性感染，預期病死率為5％～30％，是導致艾滋病患者死亡的重要因素之一。根據來源不同，肺孢子菌分為5種：人的耶氏肺孢子菌、大鼠的卡式肺孢子菌、小鼠源肺孢子菌、大鼠源肺孢子菌、兔源肺孢子菌。其中，耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii,Pj)在環境中普遍存在，可以引起人類呼吸系統感染，是導致肺孢子菌肺炎的主要病原菌，是免疫缺陷患者重要的條件致病病原體，它們通常寄生在患者的肺泡中，依賴肺部環境獲取營養物質，具有逃避宿主先天性免疫和適應性免疫的能力，臨床表現與體征不明顯，疾病進展迅速，造成患者肺功能加速惡化，病死率較高，然而早期診斷卻非常困難。

目前臨床上檢測病原菌的常規方法包括：1)呼吸道標本涂片染色鏡檢法；2)體外菌體培養鑒定法；3)組織病理學檢測法；4)血清學檢測法；5)PCR或qPCR檢測法；6)環介導等溫擴增(LAMP)法。大量實驗表明，耶氏肺泡子菌適應人體肺部生存環境，可以在肺泡細胞表面生存，卻不能在常規的培養基上生長。因此，很難通過體外培養菌體后進行常規的檢測分析及藥物篩選等。而且在感染初期耶氏肺孢子菌含量很低，又位于下呼吸道感染，難于采樣及確診，容易延誤病情。隨著分子診斷技術的快速發展，基于PCR技術的檢測方法層出不窮，例如實時定量PCR技術、多位點序列分型技術、限制性片段長度多態性分析技術、環介導等溫擴增技術等。盡管這些技術在臨床病原菌檢測中發揮了重要的作用，然而卻不能有效的從復雜樣本中檢測微量核酸拷貝數，尤其是耶氏肺孢子菌的檢測，至今還是依賴傳統的影像學和病理學檢測手段。因此急需建立一種高效靈敏、準確可靠的分子診斷方法，為肺孢子菌肺炎的早期診療提供科學依據。

發明內容

鑒于此，本發明建立了一種基于數字PCR技術檢測耶氏肺孢子菌的試劑盒及檢測方法，具有特異性好，檢測靈敏度高，抗干擾能力強的特點，突破了復雜生物樣本中痕量耶式肺孢子菌定性或定量檢測的技術瓶頸問題。

本發明目的是通過以下方式實現：

本發明提供一種基于數字PCR技術檢測耶氏肺孢子菌的試劑盒，所述試劑盒包括特異性擴增引物和熒光探針，其中，所述特異性引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

基于上述技術方案，進一步地，熒光探針類型為TaqMan探針或TaqMan-MGB探針；熒光探針的5’端和3’端分別修飾熒光基團和淬滅基團，其中，修飾5’端的熒光基團選自：FAM,HEX,TET,JOE,VIC,ROX,Cy3或Cy5，修飾3’端的淬滅基團選自：TAMRA、MGB、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

基于上述技術方案，進一步地，所述熒光探針的5’端的熒光基團為HEX,3’端的淬滅基團為MGB。