[發(fā)明專利]一種基于數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)耶氏肺孢子菌的試劑盒及檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210593956.1
• 申請(qǐng)日: 2022-05-27
• 公開（公告）號(hào): CN115029471A
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉晶;劉秀梅;王澤旭;王亮;王小強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 大連干細(xì)胞與精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責(zé)任公司 21212
• 代理人: 周媛媛;李馨

1.一種基于數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)耶氏肺孢子菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括特異性擴(kuò)增引物和熒光探針，其中，所述特異性引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，熒光探針類型為TaqMan探針或TaqMan-MGB探針,熒光探針的5’端和3’端分別修飾有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，其中，修飾5’端的熒光基團(tuán)選自：FAM,HEX,TET,JOE,VIC,ROX,Cy3或Cy5，修飾3’端的淬滅基團(tuán)選自：TAMRA、MGB、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品以及無菌水。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性質(zhì)控品是含有耶式肺孢子菌基因保守區(qū)域的重組質(zhì)粒，所述的重組質(zhì)粒中載體骨架為PUC57，所述的耶式肺孢子菌基因保守區(qū)域的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；陰性質(zhì)控品為TE緩沖液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性質(zhì)控品的構(gòu)建方法如下：人工合成耶式肺孢子菌基因保守區(qū)域的核苷酸片段，通過TA克隆連接到PUC57載體上，進(jìn)行大腸桿菌熱轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證核苷酸序列，得到重組質(zhì)粒。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的基于數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)耶氏肺孢子菌的試劑盒還包括Taq酶、dNTPs、緩沖液。

7.一種基于數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)耶氏肺孢子菌的檢測(cè)方法，其特征在于，主要包括如下步驟：

(1)對(duì)待檢樣品進(jìn)行預(yù)處理，然后使用核酸提取試劑盒提取DNA模板，使用權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述的試劑盒配制包含正向引物、反向引物、熒光探針、DNA模板的混合溶液；

(2)利用PCR微滴生成儀將步驟(1)制備的混合溶液生成微滴，再利用微滴數(shù)字PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)結(jié)束后利用微滴分析儀讀取DNA拷貝數(shù)，獲得定性或定量結(jié)果。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(1)中所述樣本包括痰液、口咽拭子、肺泡灌洗液、血液、組織提取液或排泄物。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(1)中所述混合溶液中正向引物和反向引物的摩爾濃度均為100～1000nM，熒光探針的摩爾濃度為50～500nmol/L。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)中所述的微滴數(shù)字PCR儀的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5～98℃預(yù)變性2～10分鐘，95～98℃變性30～60秒，50～60℃退火并延伸30～60秒，循環(huán)30～50次，90～100℃微滴固化5～15分鐘。