[發明專利]一種微量超長度低突變核苷酸合成方法

在審

• 申請號: 202210592840.6
• 申請日: 2022-05-27
• 公開（公告）號: CN114875021A
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 喻明軍;王維坤;崔康樂;駱曉文;陳健
• 申請（專利權）人: 通用生物（安徽）股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 合肥正則元起專利代理事務所(普通合伙) 34160
• 代理人: 胡玉

本發明涉及一種微量超長度低突變核苷酸合成方法，屬于全基因合成的長鏈O l i go生產工藝領域，包括以下步驟：步驟一、合成儀檢查和準備；步驟二、按照配方配置合成試劑：步驟三、編制合成程序試劑反應順序和步驟；步驟四、合成Fr i ts合成板：安裝好合成板、蓋好儀器蓋板，點擊運行合成儀，自動合成，最后下機，即可。本發明可提升每個堿基的反應速率，相比60bp的耦合反應更接近100％，可將用于全基因合成的引物可以延長至120bp以上，突變率卻能降低至萬分之五以下。將一對引物的重疊區占比降至8.1?11.1％，大大減少了全基因用途的引物生產總條數量，從而降低了引物成本和對環保的壓力。

技術領域

本發明屬于全基因合成的長鏈Oligo生產工藝領域，具體地，涉及一種微量超長度低突變核苷酸合成方法。

背景技術

使用單鏈DNA引物拼接完整的基因，是當前DNA合成工廠使用非常普遍的方法。但受化學合成速率限制，引物合成過程中每個堿基的耦合成功率無法達到100％，每增加合成一個堿基，目的含量則指數級下降。故可靠的用于全基因拼接的引物長度被限制在60bp左右，在引物合成各環節控制好的理想狀態下，可以得到萬分之五左右的突變率。

全基因合成中，先將基因分成若干核苷酸單鏈片段，每個片段長度控制在60個堿基左右，每對相鄰的片段之間存在約10-20個堿基的交叉重疊。混合后通過加入DNA聚合酶、dNTP等原料使用聚合酶鏈式反應法擴增出完整的片段，再連入載體中進行克隆，最后通過基因測序篩選到正確的克隆即完成了全基因合成過程。

在引物拼接過程中，為了提升全長拼接的成功率，引物之間需保持15-20堿基的重疊區。在60bp長度引物中，重疊區占一對引物總長度的14.3-20％，并且隨著引物條數的增加，重疊占比不斷上升。近年來隨著分子生物行業的火熱，每年全基因合成的需求巨大，因重疊區產生的生產浪費也越來越大。不但提高了基因合成工廠的生產成本，也提高了化學試劑消耗量，也不利于環境的保護。提升單條引物長度可以直接降低重疊區占基因總長的占比，可以有效降低成本和環保的難度，但提升了引物長度，如單堿基的反應速率沒有的提升，則最終合成得出的目的含量會指數型降低，直接降低得到正確全長的一次性成功率。

隨著微量高通量的迅猛發展，全基因合成用途的引物的產出比得到快速提升，但引物長度一直是難以突破的瓶頸。

發明內容

本發明的目的在于提供一種微量超長度低突變核苷酸合成方法，以解決背景技術中提到的問題，是從合成儀運行方式、合成試劑配方、合成程序試劑反應順序和步驟、合成Frits合成板四方面，全方位優化了Oligo的合成工藝，使單堿基合成的脫保護、耦合、帶帽、氧化四大反應速率全面超越常規60bp合成工藝，更加接近100％理論反應速度，并且克服了超長鏈核苷酸合成過程中的空間位阻效應。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

一種微量超長度低突變核苷酸合成方法，包括以下步驟：

步驟一、合成儀檢查和準備；

步驟二、按照以下配方配置合成試劑：

(1)活化劑：0.25M Pyridine(含水量≤20ppm)；

(2)單體(指亞磷酰胺單體)：單體質量：溶解液體積＝1g:30mL(含水量≤10ppm，溶解液為乙腈，且為HPLC級別)；

(3)帶帽A：30％Acetic Anhydride in ACN(含水量≤20ppm)；

(4)帶帽B：0.04M DMAP in ACN(含水量≤20ppm)；

(5)氧化劑：0.025M I₂-2.5wt％NMI-12.5wt％H₂O-85wt％THF；

(6)脫帽劑：3.5％TFA in DCM(含水量≤30ppm)；