[發(fā)明專利]一種非洲豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測方法、試劑盒及其應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2022-05-27
• 公開（公告）號: CN115032387A
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 魏建超;馬志永;楊揚(yáng);李昱昊;張妍;管志欣;張俊杰;鄭家楊;邱亞峰;李宗杰;李蓓蓓;劉珂;邵東華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;C07K14/11;C07K1/22;C12N15/34;C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 臺州浙粵壟專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33419
• 代理人: 王洪臣

1.一種非洲豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測方法，其是以ASFV非結(jié)構(gòu)蛋白B602L抗原作為目的基因，以pColdⅠ質(zhì)粒作為載體，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pColdⅠ-B602L，通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了上清表達(dá)的重組pB602L蛋白，并對大量表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行純化；以純化的pB602L蛋白作為包被抗原，建立了豬ASFV間接ELISA抗體檢測方法。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非洲豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測方法，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒pColdⅠ-B602L的構(gòu)建過程包括如下步驟：

(1)根據(jù)ASFV-SY18毒株B602L基因設(shè)計特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，在序列3'端末尾加入6個組氨酸標(biāo)簽，其中正向引物如SEQ.No.1所示，反向引物如SEQ.No.2所示；其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的組成為：2×LATaq PCR Master Mix，25μL，F(xiàn)orward Primer(10μM)2μL，ReversePrimer(10μM)2μL，質(zhì)粒模板2μL，使用ddH₂O補(bǔ)充至50μL；其中所述的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃保溫5min，PCR擴(kuò)增30個循環(huán)，其中每一循環(huán)的溫度控制依次為95℃，30s；60℃，30s；72℃按照擴(kuò)增速度為1min/kb擴(kuò)增7min，退火至4℃終止擴(kuò)增反應(yīng)；

(2)將原核表達(dá)載體pColdⅠ空載體使用EcoRⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，將酶切反應(yīng)體系加入滅菌EP管中，置37℃水浴鍋中水浴3h，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果，膠回收試劑盒回收與預(yù)期相符目的片段，得到pColdⅠ酶切產(chǎn)物，其中酶切反應(yīng)體系如下：表達(dá)載體pColdⅠ 1μg，EcoRⅠ酶1μL，XbalⅠ酶1μL，10×Cut Smart Buffer 5μL，使用ddH₂O補(bǔ)充至50μL；

(3)將鑒定正確的膠回收產(chǎn)物目的基因B602L和表達(dá)載體pColdⅠ使用同源重組試劑盒進(jìn)行連接，構(gòu)建pColdⅠ原核表達(dá)載體，連接反應(yīng)體系如下：pColdⅠ酶切產(chǎn)物30ng，ASFVB602L 120ng，2×Hieff Clone Enzyme Premix 10μL，使用ddH₂O補(bǔ)充至20μL；將連接反應(yīng)體系置于50℃水浴鍋中，反應(yīng)50min，反應(yīng)結(jié)束后立即置于冰上3min或于-20℃保存，得到同源重組連接產(chǎn)物；

(4)將同源重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，振蕩培養(yǎng)后將菌液涂布于氨芐抗性的LB平皿，置于37℃恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱中，倒置過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，置于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行菌落PCR鑒定，其反應(yīng)體系如下：2×LATaq PCR Master Mix 10μL，菌液5μL，F(xiàn)orwardPrimer(10μM)0.5μL，Reverse Primer(10μM)0.5μL，ddH₂O 4μL；

反應(yīng)程序如下：

(5)PCR反應(yīng)結(jié)束后使用1％的瓊脂糖核酸膠進(jìn)行電泳，將目的條帶的單克隆菌落，接種于含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后按照小提質(zhì)粒DNA試劑盒步驟提取質(zhì)粒，測序并確定質(zhì)粒濃度后保存-20℃，命名為pCold-B602L質(zhì)粒。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非洲豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測方法，其特征在于，所述的原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組pB602L蛋白過程包括如下步驟：將測序正確的pCold-B602L質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中，倒置過夜培養(yǎng)，37℃200rpm恒溫震蕩至菌液OD值0.6-0.8時，加入0.5mM IPTG，16℃恒溫誘導(dǎo)表達(dá)pB602L蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非洲豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測方法，其特征在于，所述的重組pB602L蛋白的純化過程包括如下步驟：將誘導(dǎo)表達(dá)pB602L蛋白后的菌液離心，使用PBS洗滌，使用預(yù)冷的裂解液重懸菌體沉淀，置于冰上，超聲裂解30min至菌體懸液變得澄清，超聲裂解菌體后在4℃，8000rpm離心30min，收獲蛋白上清，選用Ni²⁺親和層析純化重組蛋白。