[發(fā)明專利]一種番茄SlHSP17.7基因的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210587325.9
• 申請(qǐng)日: 2022-05-25
• 公開（公告）號(hào): CN114807173A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜晶;吳媛媛;劉欣;常晨亮;羅珺峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12N15/84;C12N15/66;C07K14/415;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 西安匯恩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61244
• 代理人: 張偉花

1.一種番茄SlHSP17.7基因的應(yīng)用，其特征在于，所述番茄SlHSP17.7基因在番茄植株中過表達(dá)，用于提高番茄耐低溫性；所述番茄SlHSP17.7基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種番茄SlHSP17.7基因的應(yīng)用，其特征在于，所述番茄SlHSP17.7基因在番茄植株中過表達(dá)的方法為：

S1、用引物OE17.7-F和引物OE17.7-R對(duì)番茄番茄SlHSP17.7基因的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：番茄SlHSP17.7基因的cDNA 1μL、10μmol/L的引物OE17.7-F 1μL、10μmol/L的引物OE17.7-R 1μL、2×Fast Pfu Master Mix 10μL、ddH₂O 7μL；

所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3min；94℃30s，58℃45s,72℃30s,33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；

所述引物OE17.7-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述引物OE17.7-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

S2、用限制性內(nèi)切酶BglII和限制性內(nèi)切酶BstEII對(duì)pCAMBIA3301質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠分離，切下9266bp大小的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，得到BglII/BstEII雙酶切pCAMBIA3301質(zhì)粒的回收產(chǎn)物；

所述雙酶切的反應(yīng)體系為：10×Tango buffer 4μL、限制性內(nèi)切酶BglII 1μL、限制性內(nèi)切酶BstEII 1μL、pCAMBIA3301質(zhì)粒1μL、ddH₂O 13μL；

所述雙酶切的酶切條件為：37℃2.5h,65℃20min；

S3、用重組連接酶將S1中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的目的基因片段連接到S2中得到的BglII/BstEII雙酶切pCAMBIA3301質(zhì)粒的回收產(chǎn)物中，得到連接產(chǎn)物，將所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,得到重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-Sl-sHSP17.7；

S4、將S3中得到的重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-Sl-sHSP17.7轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，侵染萌發(fā)10天的番茄子葉及下胚軸，然后經(jīng)過抑菌培養(yǎng)、生芽培養(yǎng)、生根培養(yǎng)，得到過表達(dá)植株；

S5、過表達(dá)陽性植株的鑒定：用引物BlpR-F和引物BlpR-R對(duì)S4中得到的過表達(dá)植株進(jìn)行PCR鑒定，能擴(kuò)增出為244bp片段的為過表達(dá)陽性植株；

所述PCR鑒定的反應(yīng)體系為：S1中得到的過表達(dá)植株的DNA 2μL、10μmol/L的引物BlpR-F 1μL、10μmol/L的引物BlpR-R 1μL、超保真PCR Master Mix 10μL、ddH₂O 6μL；

所述PCR鑒定的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃30s，59℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min；

所述引物BlpR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述引物BlpR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

S6、鑒定過表達(dá)陽性植株中SlHSP17.7基因的表達(dá)量：

S601、第一鏈cDNA的合成：提取S5中得到的過表達(dá)陽性植株的總RNA，測(cè)量所述總RNA的濃度，取1μg的所述總RNA用1μL的DNase I在37℃的條件下消化處理30min，然后在70℃的條件下加熱10min，之后放置冰上，依照Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒的用量加入反轉(zhuǎn)錄所需試劑，42℃孵育1h，95℃變性5min后，將反應(yīng)體系置于冰上，加入四倍體積的滅菌超純水，得到第一鏈cDNA；

S602、qRT-PCR檢測(cè)分析：

以S601中得到的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增；

以引物Actin-F和引物Actin-R為內(nèi)參引物，用引物17.7-F和引物17.7-R對(duì)S5中得到的過表達(dá)陽性植株的第一鏈cDNA進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增；

所述qRT-PCR擴(kuò)增的體系為：S5中得到的過表達(dá)陽性植株的第一鏈cDNA 2μL、10μmol/L的引物17.7-F 1μL、10μmol/L的引物17.7-R 1μL、ddH₂O 7μL、2×SYBG Green Mix 9μL；

所述qRT-PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?℃預(yù)變性3min；95℃30s，55℃30s，68℃15s，40個(gè)循環(huán)；

所述引物17.7-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述引物17.7-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述引物Actin-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述引物Actin-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

計(jì)算S5中得到的過表達(dá)陽性植株中番茄SlHSP17.7基因的相對(duì)表達(dá)值，相對(duì)表達(dá)值1，且與轉(zhuǎn)化受體材料有顯著性差異的，為番茄SlHSP17.7基因過表達(dá)植株。