[發(fā)明專利]一種喜樹中未知生物堿的快速鑒定方法

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• 申請日: 2022-05-27
• 公開（公告）號: CN114965814A
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發(fā)明（設計）人: 蒲祥;張家華;陳夢涵;林芯宇;雷明;楊勝男;王晗光;黃乾明
• 申請（專利權）人: 四川農業(yè)大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 馬歡歡

本發(fā)明提供了一種喜樹中未知生物堿的快速鑒定方法，屬于天然化合物鑒定技術領域。本發(fā)明通過誘導、孵育、離心等步驟對喜樹樣品總生物堿進行提取，以確保微量生物堿類成分的穩(wěn)定存在，結合使用自建喜樹代謝物專屬數(shù)據(jù)庫以及喜樹生物堿類成分二級質譜裂解規(guī)律，對喜樹花、果、莖、葉、幼苗中的單萜吲哚和喹啉生物堿進行快速發(fā)掘與鑒別，探索喜樹中生物堿類成分的合成代謝和富集規(guī)律。本發(fā)明的方法也適用于經AgNO₃、聚乙二醇、MeJa誘導處理或未經誘導處理的喜樹幼苗中同樣結構類別生物堿類成分的鑒別。

技術領域

本發(fā)明涉及天然化合物鑒定技術領域，尤其涉及一種喜樹中未知生物堿的快速鑒定方法。

背景技術

喜樹(Camptotheca acuminata)為藍果樹科喜樹屬喬木，因其全株均能產生具有抗癌作用的喜樹堿(CPT)而聞名。從喜樹中提取制備的CPT已作為喜樹堿類抗癌藥的原料藥。自1966年Wall從喜樹中分離制備CPT后，人們相繼從Nyssaceae、Betulaceae、Apocynaceae、Rubiaceae、Icacinaceae、Meliaceae和Violaceae 7科共43種植物中發(fā)現(xiàn)CPT。雖然Miquelia dentata(0.003％～1.418％DW)，Nothapodytes pittosporoides(0.530％DW)，Pyrenacantha volubilis(0.130％～1.350％)，Dysoxylum binectariferum(0.11％DW)四種植物中CPT含量均高于喜樹，但人們目前仍主要從喜樹(0.012％～0.500％DW)和Nothapodytes nimmoniana(0.081％～0.775％DW)中提取制備CPT。此外，通過化學成分提取分離技術，研究人員相繼從這43種植物中分離并鑒定生物堿類成分125種。其中由喜樹的樹皮、莖、葉、根和果實中分離并鑒定喹啉生物堿24種，吲哚生物堿15種。這些生物堿類成分均生源于色胺，由異胡豆苷或異胡豆酸通過脫水縮合、環(huán)氧化、環(huán)氧化水解、碳碳鍵氧化裂解、分子內重排、2位脫水、7位加氫還原、7位脫水、16位羥化、16位脫水、22位葡萄糖基水解、22位脫氫氧化、18,19位加氫還原、20位羥化等多步酶促反應衍生而成。鑒于喜樹中CYP450氧化酶、葡萄糖基轉移酶、甲基轉移酶、脫水酶通常具有豐富多樣的催化活性，可將CPT合成中間體及其衍生物進行衍生化修飾，由此確定喜樹中富含結構多樣的生物堿類成分。這些成分具有共同的生源，結構復雜，但含量較低，用傳統(tǒng)的分離提取技術難于制備和鑒定。

目前對微量次生代謝產物的鑒定方法主要有色譜-質譜聯(lián)用技術，其中液質聯(lián)用應用最為廣泛。通過對樣品提取液進行分析監(jiān)測，快速獲得大量質譜信號，根據(jù)代謝物的相對分子質量和碎片結構信息，可判斷代謝物的化學結構。基于此策略，目前已有多個在線代謝物二級質譜數(shù)據(jù)庫，如MassBank、HMDB、Metlin、Feihn library、GMD。通過數(shù)據(jù)庫檢索比對，可快速實現(xiàn)已知代謝物的鑒別。但由于植物種類以及代謝物結構類別的多樣性，目前這些參考數(shù)據(jù)庫收錄譜庫并不完整，仍在不斷更新，導致其應用受限。目前人源代謝物、植物初級代謝物、部分黃酮類成分、部分萜類成分等類別化合物可通過數(shù)據(jù)庫比對實現(xiàn)快速鑒別。但目前還未見有生物堿類成分的專屬代謝物質譜數(shù)據(jù)庫。要想實現(xiàn)生物堿類成分的快速鑒別，還需逐一對各類別生物堿類成分的質譜裂解規(guī)律進行探索與規(guī)律總結。近年，Montoro通過使用HPLC-MS/MS技術對喜樹的葉片進行了代謝物輪廓分析，實現(xiàn)了11種生物堿類成分的鑒別與定量分析。陳等將固相萃取與HPLC-MS/MS技術結合，用于喜樹果實樣品中生物堿類成分的鑒別，實現(xiàn)了30種喜樹堿類似物的鑒別。而喜樹中生物堿類成分結構多樣，現(xiàn)有研究均未對喜樹不同時期不同部位的樣品進行全面系統(tǒng)的研究。因此，亟需建立一種適用于喜樹不同組織部位樣品的快速準確的生物堿類成分鑒定方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種適用于喜樹不同組織部位樣品的未知單萜吲哚和喹啉生物堿的快速鑒定方法。

本發(fā)明的有益效果：