[發明專利]一種喜樹中未知生物堿的快速鑒定方法

在審

• 申請號: 202210586825.0
• 申請日: 2022-05-27
• 公開（公告）號: CN114965814A
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 蒲祥;張家華;陳夢涵;林芯宇;雷明;楊勝男;王晗光;黃乾明
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 馬歡歡

1.一種喜樹中未知生物堿的快速鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)對喜樹組織樣品進行前處理，得到前處理樣品；

2)通過色譜-質譜聯用檢測前處理樣品中生物堿類成分；

3)將得到的生物堿類成分的特征碎片裂解過程與生物堿裂解規律進行比對即可；

所述步驟1)中，喜樹組織樣品包括喜樹花、果、莖、葉和幼苗；

其中，a、喜樹花、果、莖、葉的前處理方法為：對喜樹的花、果、莖、葉分別順次進行破碎、孵育、離心即可；

b、喜樹幼苗的前處理方法為：將喜樹的種子培育處理得到喜樹的幼苗，對喜樹的幼苗順次進行誘導、破碎、孵育、離心即可。

2.根據權利要求1所述的喜樹中未知生物堿的快速鑒定方法，其特征在于，所述步驟a和步驟b中，破碎獨立的為將樣品用液氮預冷后研磨成粉。

3.根據權利要求1或2所述的喜樹中未知生物堿的快速鑒定方法，其特征在于，所述步驟a和步驟b中，孵育的溫度獨立的為0～10℃，孵育的時間獨立的為10～30min，孵育采用的萃取溶劑為甲醇-甲酸-水混合溶劑，所述甲醇-甲酸-水混合溶劑中甲酸的質量分數為0.1～0.3％，甲醇的質量分數為60～90％。

4.根據權利要求3所述的喜樹中未知生物堿的快速鑒定方法，其特征在于，所述步驟a和步驟b中，單個喜樹組織樣品與萃取溶劑的質量體積比為0.05～0.15g：200～700μL。

5.根據權利要求1或4所述的喜樹中未知生物堿的快速鑒定方法，其特征在于，所述步驟a和步驟b中，離心的轉速獨立的為10000～14000rpm，離心的時間獨立的為5～15min。

6.根據權利要求1所述的喜樹中未知生物堿的快速鑒定方法，其特征在于，所述步驟b中，將喜樹的種子培育處理得到喜樹的幼苗的步驟為：對去除果殼的成熟種子順次用表面活性劑和無菌水進行沖洗，將沖洗后的成熟種子順次浸泡于體積分數為60～80％的乙醇和體積分數為1～3％的NaClO溶液中，取出瀝干水分后放入MS培養基中進行常規培養至子葉萌發，即得到喜樹的幼苗；

誘導的步驟為：將得到的喜樹幼苗轉移至誘導培養基中誘導0～60d即可；

其中，表面活性劑沖洗的時間為3～5min，無菌水沖洗的時間為5～8min，浸泡于體積分數為60～80％的乙醇的時間為30～60s，浸泡于體積分數為1～3％的NaClO溶液的時間為1～3min。

7.根據權利要求6所述的喜樹中未知生物堿的快速鑒定方法，其特征在于，所述表面活性劑為體積分數為1～5％的聚乙二醇辛基苯基醚；

所述誘導培養基中含有5～20μM的MeJa、2.5～15g/L的聚乙二醇20000和5～75μM的AgNO₃。

8.根據權利要求1或6或7所述的喜樹中未知生物堿的快速鑒定方法，其特征在于，所述色譜-質譜聯用檢測中色譜檢測的條件為：

色譜柱：Hyperil Gold C₁₈柱2.1mm×100mm，1.9μm；

流動相：A為體積分數0.05～0.2％的甲酸溶液，B為乙腈；

流動相流速：0.1～0.3mL/min；

柱溫：30～40℃；

進樣量：3～10μL；

梯度淋洗的條件為：

0.0～1.5min：B的體積分數為2％；大于1.5min且小于等于12.0min：B的體積分數為2～100％；大于12.0min且小于等于14.0min：B的體積分數為100％；大于14.0min且小于等于14.1min：B的體積分數為100～2％；大于14.1min且小于等于16.0min：B的體積分數為2％。