[發明專利]草魚ctnnb1基因過表達慢病毒的構建及其在提高魚類肝細胞糖利用能力中的應用

有效

• 申請號: 202210583515.3
• 申請日: 2022-05-25
• 公開（公告）號: CN114836474B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發明（設計）人: 羅智;徐一闖;譚肖英;趙濤;魏曉雷;宋玉峰;鄭華
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 馮超

本發明公開了一種草魚ctnnb1基因過表達慢病毒的構建及其在提高魚類肝細胞糖利用能力中的應用。本發明通過構建含有編碼β?catenin蛋白的ctnnb1基因的重組慢病毒，獲得草魚ctnnb1過表達慢病毒，該慢病毒能高效地感染L8824細胞并將ctnnb1序列成功導入宿主細胞的基因組，獲得能穩定過表達ctnnb1的重組草魚肝細胞系L8824?β?catenin。過表達ctnnb1能有效提高草魚肝細胞對糖的利用能力，通過活體實驗驗證了ctnnb1表達水平與草魚肝臟利用糖的能力相關，從而為研究提高魚類肝臟利用糖的能力提供了有效的靶標，對提高魚類的生產性能和減低水產飼料成本具有重大意義。

技術領域

本發明涉及魚類生物技術領域，具體涉及一種草魚ctnnb1基因過表達慢病毒的構建及其在提高魚類肝細胞糖利用能力中的應用。

背景技術

糖類是魚類配合飼料中一類重要的廉價能源物質，適當添加糖類物質不但可以降低飼料成本，而且可以減少蛋白質的消耗，以及有利于氨基酸的活化并促進魚類的生長。但是，與哺乳動物不同，魚類對糖的利用能力較低，常表現為“葡萄糖耐受不良”，這就限制糖類在魚類飼料中的使用。改善魚類對糖類的利用能力有利于降低飼料成本和增加魚類生產性能。動物機體中存在部分基因可以調控機體對飼料中糖類物質的消化、吸收和代謝的能力。肝臟是魚類代謝反應中樞，并且是魚類代謝葡萄糖的主要場所，魚類肝臟內存在大量的糖代謝酶，如葡萄糖轉運蛋白：鈉/葡萄糖轉運蛋白1(SGLT1)；糖酵解途徑中的關鍵酶：葡萄糖激酶(GK)，丙酮酸激酶(PK)；糖異生途徑中的主要酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)。糖酵解途徑是魚體所有組織器官進行葡萄糖分解的唯一途徑，而糖異生途徑涉及到非糖底物催化合成葡萄糖的過程，調控這兩個途徑對于肝臟對糖類的利用具有非常重要的作用。

作為一種胞內蛋白，β-catenin被認為是經典Wnt/β-catenin信號通路的核心蛋白，也是該通路的效應器，Wnt/β-catenin信號通路發揮作用依賴于β-catenin在細胞核中的積聚。β-catenin主要負責將Wnt信號從細胞質傳導到細胞核內，作為轉錄共激活子與T細胞特異性轉錄因子/淋巴增強因子結合以此來調控該信號通路下游目的基因的表達。β-catenin在進化上是非常保守的，不同物種的β-catenin的相似度非常高。β-catenin參與調節細胞周期、凋亡、增殖、分化、代謝、氧化應激等多種生物學過程。同時，β-catenin在肝臟的生長、發育、再生、代謝等方面發揮著重要作用，在肝臟的生命活動中扮演著重要的角色。

綜上所述，魚類肝臟對于糖類代謝具有非常重要的作用，且β-catenin表達量和活性的改變會影響肝臟代謝。此外飼料中的多種成份對β-catenin的表達量和活性具有非常顯著的影響。研究β-catenin在肝細胞中的分子作用對促進肝臟糖類利用、降低飼料成本十分重要。因此，構建穩定過表達β-catenin的草魚肝細胞系對于研究β-catenin調控肝臟細胞對糖的利用具有非常重要的意義，并為提高魚類肝臟對糖的利用能力提供一個重要的靶標。

目前，尚未見到關于通過慢病毒感染構建穩定過表達細胞系及通過提高β-catenin水平來提高肝臟細胞對糖類的利用能力應用在經濟魚類中的報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種草魚ctnnb1基因過表達慢病毒的構建及其在提高魚類肝細胞糖利用能力中的應用；本發明以高效便捷地實現ctnnb1基因在草魚肝細胞系L8824中的穩定過表達，從而提高草魚肝細胞系對糖的利用能力，為提高魚類肝臟對糖的利用能力提供了非常有效的靶標。同時，活體葡萄糖注射實驗結果顯示草魚肝臟中ctnnb1基因水平與糖酵解途徑中的關鍵基因-gk和糖異生途徑中的關鍵基因-pepeck表達水平顯著相關，接著從蛋白水平再次驗證肝臟中β-catenin水平與肝臟利用糖的能力存在相關性。表明β-catenin蛋白水平與草魚肝臟利用糖的能力具有相關性，也表明測定β-catenin的蛋白水平還可判斷魚類肝臟對糖的利用能力。此外，本發明也為過表達慢病毒應用在其它經濟魚類細胞系中提供指導。