[發明專利]草魚ctnnb1基因過表達慢病毒的構建及其在提高魚類肝細胞糖利用能力中的應用

有效

• 申請號: 202210583515.3
• 申請日: 2022-05-25
• 公開（公告）號: CN114836474B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發明（設計）人: 羅智;徐一闖;譚肖英;趙濤;魏曉雷;宋玉峰;鄭華
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 馮超

1.一種草魚ctnnb1基因過表達慢病毒的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)ctnnb1基因過表達慢病毒載體的構建

a.以草魚全長cDNA為模板，采用下述ctnnb1 PCR擴增引物，通過PCR反應，擴增獲得ctnnb1 CDS PCR產物；其中，PCR擴增ctnnb1引物如下：

ctnnb1上游引物：

atagaagacaccgactctagaatggctacccaatctgacttgatg；

ctnnb1下游引物：

ctcaccatggtggcgaccggtcagatcggtatcaaaccaggc；

b.pLV-eGFP慢病毒表達載體通過限制性內切酶為Xba Ⅰ和Age Ⅰ進行雙酶切，得到線性化的pLV-eGFP慢病毒表達載體；

c.將ctnnb1 PCR產物與線性化的pLV-eGFP慢病毒表達載體進行重組，將得到的重組產物轉化進新鮮的感受態大腸桿菌細胞，即得到含目的基因的pLV-eGFP-ctnnb1慢病毒載體；

2)草魚ctnnb1基因過表達慢病毒的構建

將上述pLV-eGFP-ctnnb1慢病毒載體、以及慢病毒包裝輔助載體pSPAX2質粒和pMD2.G質粒同時共轉染入人胚胎腎細胞HEK293T細胞中，在該細胞中進行病毒的包裝，包裝好的病毒會被分泌到細胞外的培養基中，收集培養基，將培養基離心后取得上清液，上清液經過過濾、離心濃縮后即為草魚ctnnb1基因過表達慢病毒。

2.根據權利要求1所述草魚ctnnb1基因過表達慢病毒的構建方法，其特征在于：所述步驟2)中，pLV-eGFP-ctnnb1慢病毒載體、慢病毒包裝輔助載體pSPAX2質粒和pMD2.G質粒的質量比為4:3:1。

3.一種權利要求1所述方法構建的草魚ctnnb1基因過表達慢病毒在提高魚類肝細胞糖利用能力中的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：所述魚類為草魚。

5.一種能夠穩定過表達ctnnb1基因的重組細胞系L8824-β-catenin，其特征在于：所述重組草魚肝細胞系L8824-β-catenin中含有能夠穩定過表達草魚ctnnb1基因；所述ctnnb1基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示。

6.一種重組草魚肝細胞系L8824-β-catenin的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)按2-3×10⁵細胞/孔的密度將L8824細胞接種在6孔板上，培養24小時后將原有培養基棄去，加入2.5毫升的完全培養基，并繼續培養至細胞匯合達到30-50％；

2)將L8824細胞培養基更換為含有權利要求1所述方法構建的草魚ctnnb1基因過表達慢病毒與polybrene的新鮮培養基，培養24小時后更換含有嘌呤霉素的新鮮培養基進行篩選；得到能夠過表達ctnnb1基因的重組草魚肝細胞系L8824-β-catenin。

7.一種權利要求5或6所述重組草魚肝細胞系L8824-β-catenin在提高魚類肝細胞糖利用能力中的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于：所述魚類為草魚。

9.一種權利要求4或5所述重組草魚肝細胞系L8824-β-catenin在抵抗高濃度葡萄糖對肝細胞損傷中的應用。