[發(fā)明專利]脫鱗病毒檢測體系、引物、探針及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210568828.1
• 申請日: 2022-05-24
• 公開（公告）號: CN114891926A
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李勇;毛燦;于方兆;古群紅;蘇惠冰;李望東;盤潤洪;郭建誼;文彥東
• 申請（專利權(quán)）人: 珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心（珠海市金灣區(qū)臺灣農(nóng)民創(chuàng)業(yè)園管理委員會;珠海市農(nóng)漁業(yè)科研與推廣中心）
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 朱繼超

本發(fā)明提供了脫鱗病毒檢測體系、引物、探針及方法。所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述脫鱗病毒檢測體系包括所述引物和/或探針。所述脫鱗病毒檢測方法采用微滴式數(shù)字PCR檢測方法，即采集待測魚類的組織樣本后，提取樣本的DNA，然后以DNA為模板采用微滴式數(shù)字PCR，可準(zhǔn)確檢測出待測魚類是否感染或攜帶SDDV，本發(fā)明的微滴式數(shù)字PCR檢測方法靈敏度高，在養(yǎng)殖魚類優(yōu)質(zhì)親本選擇中具有較好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及水生動物病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及脫鱗病毒檢測體系、引物、探針及方法。

背景技術(shù)

脫鱗病毒(Scale drop disease Virus,SDDV)是一種新生魚虹彩病毒。早在2002年，馬來西亞養(yǎng)殖金目鱸出現(xiàn)脫鱗癥(Scale drop syndrome,SDS)病害。2012年，新加坡研究人員首次自SDS金目鱸觀察虹彩病毒樣病毒顆粒，但抗RSIV的單克隆抗體不能識別該病毒，提出該病毒可能是一種有別于RSIV的新型魚虹彩病毒。2015年，MSD Animal Health的研究人員自新加坡的SDS金目鱸通過細(xì)胞培養(yǎng)途徑培養(yǎng)出該病毒，命名為脫鱗病病毒(SDDV)。

黃鰭鯛具有極高的養(yǎng)殖價值，但近年來黃鰭鯛主養(yǎng)區(qū)在夏季高溫季頻繁出現(xiàn)黃鰭鯛腹水癥狀，發(fā)病魚規(guī)格10～140g不等，臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹部腫脹，有時也伴有眼球脫落，解剖可見大量黃色腹水。當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶將該病稱為“黃鰭鯛腹水病”。

國內(nèi)多個研究團隊對該病害進行了跟蹤研究，但一直沒有可信結(jié)論。2020年6月初，珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心與中山大學(xué)團隊合作，最終通過細(xì)胞培養(yǎng)方法分離到SDDV樣病毒。對該病毒系統(tǒng)的全基因組、全蛋白質(zhì)組、細(xì)胞感染病理、透射電鏡觀察、回歸感染、臨床病例、組織病理及與ISKNV的抗原交叉反應(yīng)研究，大量充分的研究證據(jù)顯示SDDV是黃鰭鯛腹水病的病毒性病原。

目前對SDDV病毒的檢測技術(shù)較少，基本存在于對國外地區(qū)的套式PCR和熒光定量PCR。但這些檢測方法的靈敏度有限，在拷貝數(shù)較少的情況下很難被檢測到，較容易出現(xiàn)假陰性。因此，有必要開發(fā)一種靈敏度高的SDDV檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供脫鱗病毒檢測體系、引物、探針及方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中所存在的一個或多個技術(shù)問題，提供至少一種有益的選擇或創(chuàng)造條件。

本發(fā)明的第一方面在于提供一對引物的核苷酸序列。所述引物為用于特異性擴增脫鱗病毒的上游引物57-F和下游引物57-R，

上游引物57-F：5’-GCACTAATGATAATGCAATTTCTGTAC-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物57-R：5’-TCACGCTCTTCGTTGGTCAG-3’(SEQ ID NO.2)。

本發(fā)明的第二方面在于提供一段探針的核苷酸序列。所述探針為用于特異性檢測脫鱗病毒的探針57-P，

探針57-P：5’-CACCCGCTCTGACTGAAGTTAGTGTTATG-3’(SEQ ID NO.3)。探針的5’端帶有熒光報告基團，如FAM、VIC、HEX、ROX、JOE、Cy3、Cy5等；3’端帶有熒光猝滅基團，如TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3等。

所述引物及所述探針均以SDDV的主要衣殼蛋白(MCP)基因序列為靶標(biāo)。

本發(fā)明的第三方面在于提供一種脫鱗病毒檢測體系。所述脫鱗病毒檢測體系包括ddPCR探針法預(yù)混液，所述ddPCR探針法預(yù)混液包括前述的引物和/或前述的探針。建立的檢測體系基于微滴式數(shù)字PCR檢測方法。該檢測體系靈敏度較高，且未存在以該檢測體系檢測SDDV的現(xiàn)有技術(shù)。