[發(fā)明專利]脫鱗病毒檢測(cè)體系、引物、探針及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210568828.1
• 申請(qǐng)日: 2022-05-24
• 公開（公告）號(hào): CN114891926A
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李勇;毛燦;于方兆;古群紅;蘇惠冰;李望東;盤潤(rùn)洪;郭建誼;文彥東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心（珠海市金灣區(qū)臺(tái)灣農(nóng)民創(chuàng)業(yè)園管理委員會(huì);珠海市農(nóng)漁業(yè)科研與推廣中心）
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 朱繼超

1.引物，其特征在于，包括用于特異性擴(kuò)增脫鱗病毒的上游引物57-F和下游引物57-R，所述上游引物57-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物57-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.探針，其特征在于，包括用于特異性檢測(cè)脫鱗病毒的探針57-P，所述探針57-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.脫鱗病毒檢測(cè)體系，其特征在于，包括ddPCR探針法預(yù)混液，所述ddPCR探針法預(yù)混液包括如權(quán)利要求1所述引物和/或權(quán)利要求2所述探針。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述脫鱗病毒檢測(cè)體系，其特征在于，所述ddPCR探針法預(yù)混液還包括DNA聚合酶和/或無RNA酶蒸餾水。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述脫鱗病毒檢測(cè)體系，其特征在于，所述ddPCR探針法預(yù)混液還包括DNA聚合酶和無RNA酶蒸餾水，所述ddPCR探針法預(yù)混液的總體積為29μL，包括：15μL 2倍濃度的Probe dPCR SuperMix、2.4μL濃度為10μM的上游引物57-F、2.4μL濃度為10μM的下游引物57-R、0.75μL濃度為10μM的探針57-P、8.45μL無RNA酶蒸餾水。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述脫鱗病毒檢測(cè)體系，其特征在于，還包括探針法ddPCR微滴生成油、ddPCR微滴檢測(cè)油、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照或無RNA酶蒸餾水中的至少一種。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述脫鱗病毒檢測(cè)體系，其特征在于，所述脫鱗病毒檢測(cè)體系包括陽性對(duì)照，所述陽性對(duì)照為含有脫鱗病毒基因序列的質(zhì)粒。

8.權(quán)利要求1所述引物、權(quán)利要求2所述探針或權(quán)利要求3至7任一項(xiàng)所述脫鱗病毒檢測(cè)體系在非診療為目的檢測(cè)脫鱗病毒中的應(yīng)用。

9.脫鱗病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括步驟：

制備PCR反應(yīng)模板：提取待測(cè)樣品的DNA，作為PCR反應(yīng)模板；

配制ddPCR反應(yīng)液：ddPCR探針法預(yù)混液29μL，PCR反應(yīng)模板1μL；

制備微滴：將8聯(lián)排管放入微滴制備儀相對(duì)應(yīng)位置，將微液滴生成芯片放入配套的生成芯片卡具中，壓下卡具固定芯片，在水孔中加入ddPCR反應(yīng)液30μL，在油孔中加入180μL微液滴生成油，然后將芯片的水孔和油孔蓋上微液滴生成芯片密封墊，將裝有微液滴生成芯片的卡具放入儀器，壓下把手固定，操作儀器運(yùn)行，生成微液滴；

擴(kuò)增：取出卡具，將含有微液滴的8聯(lián)排管蓋上密封蓋，轉(zhuǎn)入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增；

檢測(cè)：將完成PCR擴(kuò)增的微液滴8聯(lián)管和微液滴檢測(cè)芯片分別放入檢測(cè)芯片機(jī)械卡具相對(duì)應(yīng)位置，壓下卡具上蓋固定芯片，在油孔1和油孔2中分別加入430μL和500μL微液滴檢測(cè)油，蓋上微滴檢測(cè)芯片密封墊，然后將卡具放入生物芯片分析儀中，使用微滴分析儀檢測(cè)微滴進(jìn)行讀數(shù)，分析每管反應(yīng)體系中發(fā)出熒光的微滴數(shù)，顯示樣品中脫鱗病毒檢測(cè)結(jié)果。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述檢測(cè)方法，其特征在于，所述擴(kuò)增步驟中，所述擴(kuò)增的程序?yàn)?5℃預(yù)變性10分鐘；94℃變性30秒，63℃退火60秒，共40個(gè)循環(huán)；4℃恒溫，結(jié)束反應(yīng)，每步都設(shè)置1.5℃/秒的變溫速度。