[發明專利]特異性識別左旋咪唑的核酸適配體及其雙模式納米探針和應用

有效

• 申請號: 202210563028.0
• 申請日: 2022-05-23
• 公開（公告）號: CN115044587B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 段諾;李昌鑫;吳世嘉;宋銘倩;王周平
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C40B50/06;C12Q1/6806;C12N15/11;C12Q1/6876
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明涉及一種特異性識別左旋咪唑的核酸適配體及其雙模式納米探針和應用，核酸適配體的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1?3所示之一，對左旋咪唑具有高特異性和親和力，并基于該核酸適配體開發了一種雙模式納米探針，包括核酸適配體、互補鏈、AuNPs/Cu?TCPP(Fe)或AuNPs/Co?TCPP(Fe)納米片，在左旋咪唑檢測中表現良好，具有高靈敏度和準確度。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種特異性識別左旋咪唑的核酸適配體及其雙模式納米探針和應用。

背景技術

驅蟲藥用于預防或治療影響體重增加的寄生蟲感染。目前，驅蟲藥已廣泛用于人類和獸醫學以控制寄生蟲侵擾。其中一種藥物左旋咪唑已獲準用于治療包括家禽在內的各種動物的體內寄生蟲感染。左旋咪唑主要用于治療傳染性寄生蟲病，是一種合成的高效低毒的廣譜驅蟲藥。其抗蟲治療效果顯著，藥源充足，應用歷史悠久且性質穩定，對牛、羊、豬、家禽等多種動物的胃腸道線蟲和肺線蟲有良好的驅蟲活性，廣泛用于獸醫實踐。其驅蟲機理為抑制延胡索酸還原酶活性，干擾能量代謝和充當乙酰膽堿激動劑，麻痹蟲體。此外，左旋咪唑在寄生蟲神經系統中充當乙酰膽堿激動劑，導致線蟲肌肉的去極化，發生持續性收縮而致麻痹，使蟲體不能附著于腸壁，寄生蟲隨之排出體外。

由于左旋咪唑具有良好的驅蟲作用和免疫調節功能，受到畜牧養殖企業的青睞，在我國動物養殖業中有著廣泛的應用。為確保食品安全，我國、美國、歐盟和日本等許多國家或國際組織都針對動物源性左旋咪唑的含量制定了嚴格的限量標準，一般為10-100μg/kg。不合理地使用左旋咪唑或不遵守停藥期，動物組織左旋咪唑含量可能超過規定的最大殘留限量值，隨食物鏈間接被人體攝入，最終對消費者身體健康造成不良影響。

當前左旋咪唑的測定方法以色譜法為主，也會使用與不同檢測器相結合的色譜技術。包括氣相色譜法(GC-MS)、液相色譜(LC-UV、LC-MS、?LC-MS/MS)、高效液相色譜(HPLC、RP-HPLC、HPLC-UV、HPLC-MS)等。色譜法定性準確，但需要色譜級的有機試劑作流動相，運行成本較高且廢液容易造成環境污染，需要昂貴的設備或復雜的預處理及專業技術人員操作，實際應用范圍較窄。適配體是一種以指數富集配體系統進化(SELEX)技術從寡核苷酸文庫中經體外篩選得到的高親和力特異性結合靶標的單鏈寡核苷酸分子(ssDNA或RNA)，通常由20-100個堿基組成，能與靶標特異性結合，被稱為“化學抗體”。靶物質能夠誘導適配體由自由構象折疊成G-?四鏈體、發夾、假結等三維空間結構，與適配體特定位點通過氫鍵、疏水作用力、范德華力等與適配體發生非共價結合。高親和性高特異性適配體序列的獲得是適配體技術的核心。SELEX技術是目前最常用的適配體篩選手段。與大多數需要將靶標固定在固相介質上的SELEX方法相比，Capture-SELEX?的主要優勢是將DNA文庫而不是靶標固定在固相介質上，能夠針對無法固定的小分子靶標的適配體篩選，保持了靶標的原始結構。目前適配體在獸藥殘留檢測中已有一定的應用，但尚未有關于左旋咪唑特異性適配體篩選研究的報道。基于此，開發一種靈敏、高效、簡便針對左旋咪唑殘留的適配體檢測新技術具有非常重要的意義。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種特異性識別左旋咪唑的核酸適配體，具有特異性高、穩定性高、合成方便、易標記功能基團等特點，并基于該核酸適配體開發了一種雙模式探針，可用于左旋咪唑的檢測。

本發明的第一個目的是提供一種特異性識別左旋咪唑的核酸適配體，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1-3所示之一，具體序列為：

LEV-5：

5′-AATCAAACGCTAAGGTCAAGGGAGAGTGCACCCATTCTTGGGG?CCCCGGGCCAGCCCCGACACGCCGCCGAAGCTTGGTACCCGTATCGT-3?′；

LEV-1：