[發明專利]一種人間充質干細胞復合nPRF制劑的制備方法

在審

• 申請號: 202210560062.2
• 申請日: 2022-05-23
• 公開（公告）號: CN114869912A
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 劉斌
• 申請（專利權）人: 西安中美弘康生物科技有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61K35/19;A61P17/18;A61P19/02;A61P19/08;A61P29/00;C12N5/0775
• 代理公司: 安徽力瀾律師事務所 34127
• 代理人: 孫偉明

1.一種人間充質干細胞復合nPRF制劑的制備方法，其特征在于，包括以下三部分：

（1）人間充質干細胞懸浮液制備步驟：

a、原代培養：組織來源：人胎兒附屬組織、兒童換牙期乳磨牙牙髓組織或成人脂肪組織；

b、傳代培養：原代細胞培養成活后，當細胞長至瓶底面積85%，用0.25%胰蛋白酶溶液消化、收集貼壁的成纖維樣細胞，進行細胞計數，以5×10⁴/ml的傳代培養；

c、干細胞鑒定：收集P2代細胞進行相關鑒定，鑒定內容包括細胞形態：倒置顯微鏡下觀察；②流式細胞儀分析細胞表面CD分子表型；③分化誘導潛能：分別進行成骨誘導、成脂誘導及成軟骨誘導實驗；

d、人間充質干細胞懸浮液制備：取P2-P5代人間充質干細胞，0.25%用胰蛋白酶消化、收集細胞，進行細胞計數，根據需求調整細胞密度，得到人間充質干細胞懸浮液，備用，并留樣進行細胞計數、細胞活力測定、熱源及無菌測試；

（2）人納米微粒富血小板纖維蛋白（nPRF）溶液制備步驟：

a、采集：使用無菌非抗凝靜脈血樣采集容器采集自體肘靜脈外周血10ml，備用；

b、離心：然后將無菌非抗凝靜脈血樣采集容器放入水平離心機中離心，離心機的轉速為2500rpm，離心10min，然后取出無菌非抗凝靜脈血樣采集容器，并在室溫下靜置10-20min；

c、制備nPRF制劑：用滅菌不銹鋼彎匙從無菌非抗凝靜脈血樣采集容器中取出富血小板纖維蛋白凝膠，放在滅菌平皿中，用滅菌眼科彎剪剪碎至1mm³大小，將富血小板纖維蛋白移入勻漿杯中，補加5ml的滅菌生理鹽水；然后在超凈工作臺中，安裝及調整可調高速勻漿機，固定好勻漿刀頭和勻漿杯，然后啟動可調高速勻漿機，工作轉速14000rpm,并啟動2min，然后，取勻漿杯，用5ml的注射器抽取勻漿杯中的上清液，該上清液中為直徑為50-150nm的納米微粒富血小板纖維蛋白，得到人納米微粒富血小板纖維蛋白溶液，備用；

（3）人間充質干細胞復合nPRF制劑的制備和應用：將人間充質干細胞懸浮液和人納米微粒富血小板纖維蛋白溶液按照4：1或5：1體積比，在無菌條件下進行混勻，在不超過1h內，注射于人體局部皮下、關節腔及頸椎或腰椎。

2.根據權利要求1所述的一種人間充質干細胞復合nPRF制劑的制備方法，其特征在于，該人胎兒附屬組織為：臍帶、胎盤或羊膜。

3.根據權利要求1所述的一種人間充質干細胞復合nPRF制劑的制備方法，其特征在于，該原代培養的培養方法采用組織塊法或消化法。