[發(fā)明專利]一種人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合nPRF制劑的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210560062.2
• 申請(qǐng)日: 2022-05-23
• 公開（公告）號(hào): CN114869912A
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西安中美弘康生物科技有限公司
• 主分類號(hào): A61K35/28
• 分類號(hào): A61K35/28;A61K35/19;A61P17/18;A61P19/02;A61P19/08;A61P29/00;C12N5/0775
• 代理公司: 安徽力瀾律師事務(wù)所 34127
• 代理人: 孫偉明

本發(fā)明公開了一種人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合nPRF制劑的制備方法,涉及生物技術(shù)及生物治療領(lǐng)域；本發(fā)明將來(lái)源于胎兒附屬組織（臍帶、胎盤、羊膜）或牙髓、脂肪、骨髓等組織分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，與由外周血分離制備的納米微粒nPRF按一定比例混合，制成一種干細(xì)胞復(fù)合nPRF制劑；該制劑不同于成分單一的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，它不僅保留了間充質(zhì)干細(xì)胞的全部特性，又賦予增強(qiáng)干細(xì)胞的增殖活性和分化誘導(dǎo)活性。其最大優(yōu)勢(shì)在于nPRF納米微粒保留富血小板纖維蛋白持久緩釋生長(zhǎng)因子的特性，有利于緩釋的多種生長(zhǎng)因子對(duì)干細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)作用；該制劑適用于人體組織局部注射應(yīng)用，例如，面部抗衰、膝骨性關(guān)節(jié)炎等。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和生物治療的領(lǐng)域，特別涉及一種人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合nPRF制劑的制備方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是一類具有自我更新能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下可分化成多種功能的細(xì)胞。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞具有5大生物學(xué)作用：①替代與修復(fù)受損和死亡細(xì)胞；②激活休眠和處于抑制狀態(tài)的細(xì)胞；③旁分泌作用；④免疫調(diào)控機(jī)制；⑤促進(jìn)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)恢復(fù)；間充質(zhì)干細(xì)胞不僅存在于胚胎，而且存在于成人體內(nèi)，可以從臍血、臍帶、胎盤、骨髓、脂肪、血液等組織中分離出相應(yīng)的干細(xì)胞；通過(guò)體外分離、提純、培養(yǎng)、增殖、鑒定等一系列過(guò)程，獲得臨床應(yīng)用所需要的間充質(zhì)干細(xì)胞；然后通過(guò)靜脈注射或介入等方法進(jìn)行回輸干預(yù)，間充質(zhì)干細(xì)胞移動(dòng)到受損器官和組織周圍，起到促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)、再生、更新的作用，應(yīng)用于脊髓損傷、糖尿病、缺血性心臟疾病等傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)方法無(wú)法醫(yī)治的疾病。

富血小板纖維蛋白（PRF）是在2001年由法國(guó)科學(xué)家Choukroun等人發(fā)現(xiàn)，是繼富血小板血漿（PRP）后第二代血小板濃縮制品，被定義為自體的白細(xì)胞和富血小板纖維生物材料；富血小板纖維蛋白（PRF）富含多種生長(zhǎng)因子，例如PDGF、VEGF、IGF、FGF、EGF等，它們具有誘導(dǎo)干細(xì)胞分化及促進(jìn)干細(xì)胞增殖的作用；目前，PRF已廣泛應(yīng)用于口腔科、頜面外科、骨科、整形外科等學(xué)科。

我們以前的研究表明，將制備出的PRF凝膠顆粒與自體脂肪顆粒和血管基質(zhì)成分（含有脂肪來(lái)源干細(xì)胞）按一定比例混合，應(yīng)用于自體脂肪移植術(shù)中，能夠顯著提高自體脂肪的成活率；提示，間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合PRF優(yōu)于單純應(yīng)用MSCs的效果。

目前，干細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究的應(yīng)用方式無(wú)論是全身應(yīng)用，還是局部應(yīng)用，主要是成分單一的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑。尤其是在局部應(yīng)用時(shí)，成分單一的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑治療效果欠佳。干細(xì)胞在特定組織微環(huán)境條件下的存活、增殖及分化都會(huì)受到一定程度的影響。如果在干細(xì)胞制劑中復(fù)合一定濃度的納米微粒PRF，將會(huì)增強(qiáng)干細(xì)胞的存活、增殖及分化的效應(yīng)。由于PRF的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)，使得生長(zhǎng)因子可以相對(duì)持久的釋放，比如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，血小板衍生生長(zhǎng)因子，表皮生長(zhǎng)因子，類胰島素生長(zhǎng)因子以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等等，而這其中多種生長(zhǎng)因子都有促進(jìn)組織生長(zhǎng)修復(fù)的功能，更大限度地滿足了臨床需求。因此，本申請(qǐng)制作了一種人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合nPRF制劑及其制備方法和用途。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合nPRF制劑的制備方法，以解決背景技術(shù)中描述的現(xiàn)有技術(shù)中成分單一的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑治療效果欠佳的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下的技術(shù)方案：一種人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合nPRF制劑的制備方法，包括以下步驟：

1、一種人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合nPRF制劑及其制備方法，其特征在于，包括以下三部分：

（1）人間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮液制備步驟：

a、原代培養(yǎng)：組織來(lái)源：人胎兒附屬組織、兒童換牙期乳磨牙牙髓組織或成人脂肪組織；

b、傳代培養(yǎng)：原代細(xì)胞培養(yǎng)成活后，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底面積85%，用0.25%胰蛋白酶溶液消化、收集貼壁的成纖維樣細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×10⁴/ml的傳代培養(yǎng)；

c、干細(xì)胞鑒定：收集P2代細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)鑒定，鑒定內(nèi)容包括細(xì)胞形態(tài)：倒置顯微鏡下觀察；②流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面CD分子表型；③分化誘導(dǎo)潛能：分別進(jìn)行成骨誘導(dǎo)、成脂誘導(dǎo)及成軟骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)；