[發明專利]一種單細胞蛋白檢測雙層水凝膠及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202210547905.5
• 申請日: 2022-05-18
• 公開（公告）號: CN115128148A
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 丁顯廷;段小倩
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發明公開了一種超靈敏的單細胞蛋白檢測雙層水凝膠，涉及痕量蛋白檢測凝膠技術領域。包括位于下層的聚丙烯酰胺凝膠，所述聚丙烯酰胺凝膠上間隔均勻設置有微孔陣列，所述微孔陣列內載入有單細胞懸液，且聚丙烯凝膠上方鋪設有瓊脂糖凝膠蓋，所述瓊脂糖凝膠蓋覆蓋所述微孔陣列內的單細胞懸液并形成雙層水凝膠的上層。本發明通過在聚丙烯酰胺微孔陣列凝膠上形成一層封閉的瓊脂糖凝膠，既有閉合微孔降低蛋白溶液損失的優勢，又可以保證蛋白質更好的變性便于后續的蛋白質電泳，檢測靈敏度高。

技術領域

本發明涉及一種新的痕量蛋白檢測凝膠，特別是涉及一種單細胞蛋白檢測雙層水凝膠及其制備方法和應用。

背景技術

在任何的細胞群體中，單個細胞之間的差異總是存在的。在腫瘤研究領域，其細胞異質性在很大程度上真正反映了癌癥的發生發展。探究細胞間的異質性在癌癥的臨床治療和預測中至關重要。對于細胞間基因組和轉錄組的異質性研究正在大量開展，然而，研究發現mRNA和蛋白質表達是不相關的。蛋白質執行細胞的功能，細胞的蛋白質含量的變化會直接影響著細胞的表型。為了充分的了解癌癥細胞群體中的多樣復雜性，研究人員需要在現有的蛋白分析技術基礎上達到單細胞分辨率的精度分析。

單細胞免疫印跡分析技術是Amy Herr研究團隊提出的一項能夠測量復雜細胞群中細胞間異質性的高特異性蛋白質分析技術。其結合了聚丙烯酰胺凝膠蛋白質電泳的分子篩效應，基于微孔陣列芯片完成了單細胞的分離，通過原位裂解細胞以及原位電泳的方式實現了單細胞蛋白檢測。

該技術基于一塊聚丙烯酰胺凝膠的微孔陣列芯片，操作步驟如下：(1)懸浮的單細胞受重力沉降落入芯片上的微孔內；(2)倒入細胞裂解和電泳液，細胞裂解；(3)對微孔內的細胞蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；(4)將凝膠芯片取出暴露在紫外光下，蛋白質跟凝膠內基質反應從而被固定在凝膠上；(5)對固定在芯片上的蛋白進行熒光抗體孵育，芯片熒光掃描儀對熒光信號檢出。在這個過程中，基于原位裂解的方式目前存在一定的問題：

開放式的微孔腔室內的細胞在經過裂解后，蛋白溶液會隨著熱的電泳液溢出孔外，尤其是在加熱的電泳液倒入之后，細胞裂解后，一部分蛋白會由于熱分子運動流失在電泳液里，從而沒有參與后續的凝膠電泳。該步驟造成將近90％的蛋白質損失，損失的蛋白質后續不會被檢出，大大的降低了單細胞蛋白免疫檢測的靈敏度，這種由于擴散而導致的蛋白質損失有不確定性，會干擾分析單細胞蛋白表達之間的異質性，并且，這也不適用于對于低表達量的蛋白檢測，比如最近幾年發現的CRISPR-Cas9敲除細胞系里產生的截短蛋白，這種蛋白被證明是低于正常蛋白的表達量的，因而，對于單細胞中痕量蛋白的檢測十分不利。

因此，本領域的技術人員致力于開發一種新型的超靈敏的單細胞蛋白檢測水凝膠，應用于單細胞的痕量蛋白免疫印跡研究。

發明內容

有鑒于現有技術的上述缺陷，本發明所要解決的技術問題是提供一種可以用于單細胞痕量蛋白檢測的一種新型的超靈敏的單細胞蛋白檢測雙層水凝膠及其制備方法和應用，其通過在聚丙烯酰胺微孔陣列凝膠上形成一層封閉的瓊脂糖凝膠，既有閉合微孔降低蛋白溶液損失的優勢，又可以保證蛋白質更好的變性便于后續的蛋白質電泳。

為實現上述目的，本發明提供了一種超靈敏的單細胞蛋白檢測雙層水凝膠，包括位于下層的聚丙烯酰胺凝膠，所述聚丙烯酰胺凝膠上間隔均勻設置有微孔陣列，所述微孔陣列內載入有單細胞懸液，且聚丙烯凝膠上方鋪設有瓊脂糖凝膠蓋，所述瓊脂糖凝膠蓋覆蓋所述微孔陣列內的單細胞懸液并形成雙層水凝膠的上層。

其中，本發明中，所述瓊脂糖凝膠采用如下方法制備：將1％的瓊脂糖加熱后溶解在裂解緩沖液中，然后置于55℃水浴鍋中保存。

進一步的，所述裂解緩沖液為RIPA-like裂解液，所述RIPA-like裂解液終濃度為0.5％SDS、0.1％v/v Triton X-100、0.25％脫氧膽酸鈉、12.5mM Tris、96mM glycine的混合液，pH 8.3。