[發明專利]一種單細胞蛋白檢測雙層水凝膠及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202210547905.5
• 申請日: 2022-05-18
• 公開（公告）號: CN115128148A
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 丁顯廷;段小倩
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

1.一種超靈敏的單細胞蛋白檢測雙層水凝膠，其特征在于：包括位于下層的聚丙烯酰胺凝膠，所述聚丙烯酰胺凝膠上間隔均勻設置有微孔陣列，所述微孔陣列內載入有單細胞懸液，且聚丙烯凝膠上方鋪設有瓊脂糖凝膠蓋，所述瓊脂糖凝膠蓋覆蓋所述微孔陣列內的單細胞懸液并形成雙層水凝膠的上層。

2.如權利要求1所述的超靈敏的單細胞蛋白檢測雙層水凝膠，其特征在于：所述瓊脂糖凝膠采用如下方法制備：將1％的瓊脂糖加熱后溶解在裂解緩沖液中，然后置于55℃水浴鍋中保存。

3.如權利要求2所述的超靈敏的單細胞蛋白檢測雙層水凝膠，其特征在于：所述裂解緩沖液為RIPA-like裂解液，所述RIPA-like裂解液終濃度為0.5％SDS、0.1％v/v Triton X-100、0.25％脫氧膽酸鈉、12.5mM Tris、96mM glycine的混合液，pH 8.3。

4.如權利要求1-3任一項所述的超靈敏的單細胞蛋白檢測雙層水凝膠的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1聚丙烯酰胺凝膠的制備：在1.5ml Ep管內，加入25μL 1.5M pH8.8 Tris-Hcl，和166.70μL 30％的混合液，所述混合液為丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺的混合液，再依次加入265.30μL ddH₂O和4μL的光敏分子,配置成膠前體溶液，最后加入10μL 5％SDS，10μL 5％TritonX-100，4μL APS，4μL TEMED，輕輕搖勻，即得；

S2制備微孔陣列的聚丙烯酰胺凝膠：滴加S1中制備得到的聚丙烯酰胺凝膠溶液于微孔模具上，并輕緩蓋上玻片，避免氣泡產生，靜置20min，待膠凝固，剝離模具，制成微孔陣列的聚丙烯酰胺凝膠；

S3載入單細胞懸液：將單細胞懸液從微孔陣列的聚丙烯酰胺凝膠上方注入，單個細胞被微孔捕獲；

S4雙層水凝膠的制備：將瓊脂糖凝膠溶液放置室溫后，從微孔陣列的聚丙烯酰胺凝膠邊緣緩慢滴加瓊脂糖凝膠，瓊脂糖凝膠在5秒內迅速凝膠化，并在微孔陣列的聚丙烯酰胺凝膠上形成一薄層蓋子，得到封閉的含有單細胞的雙層水凝膠。

5.如權利要求4所述的超靈敏的單細胞蛋白檢測雙層水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟S1中，所述混合液中丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的體積比為29:1。

6.如權利要求4所述的超靈敏的單細胞蛋白檢測雙層水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟S2中，所述微孔模具為硅片上含有1000個直徑和高度都是60μm的微孔。

7.如權利要求4所述的超靈敏的單細胞蛋白檢測雙層水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟S3中，所述單細胞懸液的細胞濃度為1×10⁵個/mL，滴加到所述微孔陣列的聚丙烯酰胺凝膠上的單細胞懸液體積為200μL。

8.如權利要求4所述的超靈敏的單細胞蛋白檢測雙層水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟S4中，從微孔陣列的聚丙烯酰胺凝膠邊緣滴加的瓊脂糖凝膠的體積為500μL。

9.一種如權利要求1-3任一項所述的超靈敏的單細胞蛋白檢測雙層水凝膠或如權利要求4-8任一項所述的超靈敏的單細胞蛋白檢測雙層水凝膠的制備方法制備而成的雙層水凝膠在單細胞蛋白檢測中的應用。

10.如權利要求9所述的應用，其特征在于：所述雙層水凝膠用于單細胞蛋白檢測的方法如下：

S11將雙層水凝膠放入電泳槽后，緩緩倒入20mL的RIPA-like裂解液，孵育裂解10s，然后進行單細胞免疫印跡凝膠電泳；

S12待電泳完成后，取下瓊脂糖凝膠，然后放入紫外燈下固定電泳后的蛋白，再進行抗體孵育和信號檢測。