[發明專利]ApoA5基因敲除倉鼠模型的構建方法

在審

• 申請號: 202210545600.0
• 申請日: 2022-05-19
• 公開（公告）號: CN114703230A
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 冼勛德;王宇輝;黃薇;張玲
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/89;C12N15/113;C12N15/12;A01K67/027
• 代理公司: 北京箐昱專利代理事務所(普通合伙) 16105
• 代理人: 彭毅

本發明適用于疾病動物模型構建領域，提供了ApoA5基因敲除倉鼠模型的構建方法，包括以下步驟：設計倉鼠ApoA5基因特異性打靶序列，制備cas9mRNA和sgRNA；收集和培養倉鼠受精卵；顯微注射：將所述sgRNA和cas9mRNA共同注射至倉鼠受精卵的細胞質中；將顯微注射后的受精卵植入代孕倉鼠體內，F0代倉鼠出生。本發明利用最新的CRISPR/Cas9基因編輯技術在擬人化倉鼠模型上敲除ApoA5基因，構建新型可模擬人類高甘油三酯血癥的動物模型，探究ApoA5在高甘油三酯血癥與動脈粥樣硬化疾病中的作用。

技術領域

本發明屬于疾病動物模型構建領域，尤其涉及ApoA5基因敲除倉鼠模型的構建方法。

背景技術

載脂蛋白A5(apolipoprotein A5，ApoA5)(gene ID：116519；OMIM accessionnumber：606368)是2001年Rubin等人通過比對人和小鼠調控膽固醇和甘油三酯代謝的ApoA1/A5/A4基因簇編碼序列時確認的一個載脂蛋白家族新成員，位于人類11號染色體長臂q23區域，ApoA4基因簇下游30kbp位置。該基因全長1889bp，包含4個外顯子和3個內含子，其起始密碼子在第2外顯子上，可編碼366個氨基酸殘基。人ApoA5蛋白由343個氨基酸組成，分子量約為39kD，呈高疏水性，主要在肝臟合成，極少量來源于小腸。在血漿中，ApoA5存在于乳糜微粒(chylomicron，CM)、LDL和HDL中，但含量很低，約為0.1-0.4mg/mL，僅為血漿ApoB蛋白含量的千分之一。

早在2001年美國研究人員即發現在小鼠體內敲除ApoA5基因后，小鼠血漿甘油三酯僅升高2-4倍(150-350mg/dl)，并沒有展現出與人類ApoA5缺陷相似的極度高甘油三酯血癥，無法模擬臨床病人的甘油三酯代謝特征；然而在小鼠體內過表達ApoA5，小鼠血漿甘油三酯降低約1/3，并且無論過表達還是敲除ApoA5均對小鼠血漿膽固醇水平無顯著影響，提示ApoA5可以負向調控血漿甘油三酯水平。

目前，推測其對血漿甘油三酯代謝的調控可能通過三條途徑：(1)LPL的激動劑，通過促進富含甘油三酯的脂蛋白(triglycerides-rich lipoprotein，TRL)顆粒與血管內皮細胞表面的糖基磷脂酰肌醇高密度脂蛋白結合蛋白1(glycosylphosphatidylinositolanchored high density lipoprotein binding protein 1，GPIHBP1)或硫酸肝素蛋白聚糖(heparin sulphate proteoglycans，HSPG)的結合，促進TRL水解；(2)抑制肝臟極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)分泌；(3)通過和低密度脂蛋白受體(LDLR)家族成員結合促進肝臟對殘體脂蛋白的攝取。但是，ApoA5是否還存在其他的甘油三酯調控機制目前仍然不清楚。

因此，針對以上現狀，迫切需要開發ApoA5基因敲除倉鼠模型的構建方法，以克服當前實際應用中的不足。

發明內容

本發明的目的在于提供ApoA5基因敲除倉鼠模型的構建方法，旨在解決上述背景中提到的問題。

本發明是這樣實現的，ApoA5基因敲除倉鼠模型的構建方法，包括以下步驟：

步驟一、設計倉鼠ApoA5基因特異性打靶序列，制備cas9 mRNA和sgRNA；

步驟二、收集和培養倉鼠受精卵；

步驟三、顯微注射：將所述sgRNA和cas9 mRNA共同注射至倉鼠受精卵的細胞質中；

步驟四、將顯微注射后的受精卵植入代孕倉鼠體內，F0代倉鼠出生。