[發明專利]Heg1基因點突變小鼠模型、其構建方法及應用

有效

• 申請號: 202210543324.4
• 申請日: 2022-05-19
• 公開（公告）號: CN114736926B
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發明（設計）人: 田靜;王志浩;張東偉
• 申請（專利權）人: 蘇州藥諾泰克新藥研發有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N15/90;C12N5/10;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 蘇州謹和知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32295
• 代理人: 許冬瑩

本申請具體涉及Heg1基因點突變小鼠模型、其構建方法及應用。該構建方法包括：S1、構建Heg1基因點突變敲入的打靶載體；S2、經過質粒提取和線性化后，將打靶載體轉染至ES細胞；S3、篩選鑒定陽性ES細胞，獲得正確同源重組的陽性克隆，再將克隆的陽性ES細胞注入供體小鼠的囊胚中，獲得嵌合鼠；S4、將嵌合鼠與Flp小鼠交配得到F1代小鼠，篩選得到去除打靶載體中的Neo的F1代雜合子小鼠；S5、將F1代雜合子小鼠進行自交得到F2代小鼠，篩選得到隱性純和突變小鼠即為Heg1基因點突變小鼠模型。本申請實施例的技術方案能夠應用于顱縫早閉綜合征相關預防、治療或診斷藥物的研發，在顱縫早閉手術、先天性心臟病救治的致病機理、治療方法、藥物篩選等方面有重要意義。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種Heg1基因點突變小鼠模型、其構建方法及應用。

背景技術

先天性顱縫早閉癥是顱骨一個或多個顱縫發生過早的骨性融合，顱縫旁的顱骨及腦組織生長受限，導致顱腔和眶腔狹小、顱內高壓、顱頜面畸形的疾病。顱縫早閉癥是最常見的先天性顱頜面畸形之一，新生兒中發病率為0.03％～0.05％，居常見顱面發育畸形發病率的第2位(約為1/2000，僅次于唇腭裂畸形)。顱縫早閉發生于胚胎期，出生后隨著年齡增長逐漸加重。顱縫早閉不僅造成顱面骨骼發育異常，更嚴重的是使患兒的大腦發育受到限制。對于先天性顱縫早閉癥的早期診斷、早期治療，保障大腦生長發育及視覺功能等顯得尤為重要。

Heg1基因的首次發現是在進行ENU誘導的斑馬魚大規模突變及性狀篩選的過程之中，該基因突變缺失后的斑馬魚及小鼠均表現出心臟腔室的異常擴張及腺體的膨大。HEG1蛋白屬于具有一次跨膜結構域的受體分子，具有高度保守的胞內段結構域，其蛋白C端被證實可以與CCM1、RASIP1等分子相結合，繼而與下游其他蛋白進行連接作用。目前尚未發現與Heg1基因有關的顱縫早閉合并先天性心臟病綜合征的報道，相應的治療方法也未展開過系統研究。

基于上述情況，特提出本申請。

發明內容

本發明的目的在于提供一種Heg1基因點突變小鼠模型、其構建方法及應用，能夠應用于顱縫早閉綜合征相關預防、治療或診斷藥物的研發，在顱縫早閉手術、先天性心臟病救治的致病機理、治療方法、藥物篩選等方面有重要意義。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

第一方面，提供一種Heg1基因點突變小鼠模型的構建方法，其特征在于，包括：

S1、構建Heg1基因點突變的打靶載體；

S2、經過質粒提取和線性化后，將所述打靶載體轉染至ES細胞；

S3、篩選鑒定陽性ES細胞，獲得正確同源重組的陽性克隆，再將克隆的陽性ES細胞注入供體小鼠的囊胚中，獲得嵌合鼠；

S4、將嵌合鼠與Flp小鼠交配得到F1代小鼠，篩選得到去除打靶載體中的Neo的F1代雜合子小鼠；

S5、將F1代雜合子小鼠進行自交得到F2代小鼠，篩選得到隱性純和突變小鼠即為Heg1基因點突變小鼠模型。

在一些可能的實施方式中，步驟S1中，所述構建Heg1基因點突變的打靶載體包括：

在所述Heg1基因上選擇待突變的靶位點，根據所述靶位點的外顯子序列，設計并構造對應所述靶位點的打靶載體序列。

在一些可能的實施方式中，所述靶位點為c.73_74insTGA；和/或，所述打靶載體包括1.0kb?5’同源臂、PM區域、PGK-Neo-polyA、2.4kb?3’同源臂和MC1-TK-polyA負篩選標記。

在一些可能的實施方式中，步驟S2中，所述線性化包括：

在所述打靶載體中插入酶切位點，調節酶切位點控制同源臂序列長度，將載體酶切后進行膠回收。