[發(fā)明專利]Heg1基因點(diǎn)突變小鼠模型、其構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210543324.4
• 申請日: 2022-05-19
• 公開（公告）號: CN114736926B
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 田靜;王志浩;張東偉
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州藥諾泰克新藥研發(fā)有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N15/90;C12N5/10;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 蘇州謹(jǐn)和知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32295
• 代理人: 許冬瑩

1.Heg1基因點(diǎn)突變小鼠模型的構(gòu)建方法或Heg1基因點(diǎn)突變小鼠模型或其子代在不以疾病的診斷和治療為目的的顱縫早閉綜合征相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用，其特征在于，所述Heg1基因點(diǎn)突變?yōu)閏.73_74insTGA。

2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括在制備或篩選預(yù)防、診斷或者治療顱縫早閉綜合征及相關(guān)并發(fā)癥藥物的用途。

3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括：

S1、構(gòu)建Heg1基因點(diǎn)突變敲入的打靶載體；

S2、經(jīng)過質(zhì)粒提取和線性化后，將所述打靶載體轉(zhuǎn)染至ES細(xì)胞；

S3、篩選鑒定陽性ES細(xì)胞，獲得正確同源重組的陽性克隆，再將陽性ES細(xì)胞克隆注入供體小鼠的囊胚中，獲得嵌合鼠；

S4、將所述嵌合鼠與Flp小鼠交配得到F1代小鼠，篩選得到去除打靶載體中的Neo的F1代雜合子小鼠；

S5、將所述F1代雜合子小鼠進(jìn)行自交得到F2代小鼠，篩選得到隱性純和突變小鼠即為Heg1基因點(diǎn)突變小鼠模型。

4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟S1中，所述構(gòu)建Heg1基因點(diǎn)突變的打靶載體包括：

在所述Heg1基因上選擇待突變的靶位點(diǎn)，根據(jù)所述靶位點(diǎn)的外顯子序列，設(shè)計并構(gòu)造對應(yīng)所述靶位點(diǎn)的打靶載體序列。

5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述打靶載體包括1.0kb?5’同源臂、PM區(qū)域、PGK-Neo-polyA、2.4kb?3’同源臂和MC1-TK-polyA負(fù)篩選標(biāo)記。

6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟S2中，所述線性化包括：

在所述打靶載體中插入酶切位點(diǎn)，調(diào)節(jié)酶切位點(diǎn)控制同源臂序列長度，將載體酶切后進(jìn)行膠回收。

7.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟S3中，所述篩選鑒定陽性ES細(xì)胞包括：

以長片段PCR方式檢測Heg1?Knock-In細(xì)胞陽性突變克隆株，所使用的引物的堿基序列如SEQ?ID?NO.1至SEQ?ID?NO.4所示。

8.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟S4中，還包括：

對F1代小鼠進(jìn)行基因敲入驗(yàn)證，所使用的引物的堿基序列如SEQ?ID?NO.5至SEQ?IDNO.8所示；

對F1代小鼠進(jìn)行基因分型，所使用的引物的堿基序列如SEQ?ID?NO.9至SEQ?ID?NO.12所示。

9.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟S5中，還包括：

對F2代小鼠進(jìn)行基因分型，所使用的引物的堿基序列如SEQ?ID?NO.13和SEQ?ID?NO.14所示。