[發明專利]一組快速檢測新冠病毒S基因點突變的核酸探針及方法

在審

• 申請號: 202210542888.6
• 申請日: 2022-05-18
• 公開（公告）號: CN115094163A
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 羅志丹;許恒皓;王欣竹;張新亞;盧辰;張建;吳芳
• 申請（專利權）人: 江蘇省海洋資源開發研究院（連云港）
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6858;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京和聯順知識產權代理有限公司 11621
• 代理人: 胡楊

本發明公開了一組快速檢測新冠病毒S基因點突變的核酸探針及方法，包括檢測新冠病毒S基因N679K突變的鎖式探針PLP?1，超分支滾環擴增引物組RCA?F和RCA?R以及檢測擴增產物所用sgRNA，所述檢測新冠病毒S基因N679K突變的鎖式探針PLP?1，超分支滾環擴增引物組RCA?F和RCA?R均為單鏈DNA；所述鎖式探針PLP?1的核苷酸堿基序列為SEQIDNo.1所示，其中5’端具備磷酸化修飾；所述超分支滾環擴增引物組包含2條引物，核苷酸堿基序列分別為為SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。本發明將鎖式探針、超分支滾環擴增反應和CRISPR/Cas12技術聯用，可以檢測長度低至50nt、高度降解的碎片化病毒RNA中所含有的點突變，操作簡單，靈敏度高，反應時間短。

技術領域

本發明涉及生物化學與分子生物學領域，具體為一組快速檢測新冠病毒S基因點突變的核酸探針及方法。

背景技術

新冠病毒屬于單鏈正義RNA病毒，在復制過程中十分容易發生突變。目前世界衛生組織認定需要關注的變異毒株有“阿爾法” (Alpha)、“貝塔”(Beta)、伽瑪”(Gamma)、“德爾塔”(Delta)和“奧密克戎”(Omicron)等。這些突變株與新冠病毒原始毒株相比，傳染性和毒性都發生了很大改變。奧密克戎(Omicron)突變株是目前突變最多、最傳染力最強的新冠病毒變異株，其刺突蛋白(S蛋白)至少包含32個突變位點，其中，H655Y、N679K和P681H突變會增強刺突蛋白的切割和與宿主細胞的融合，可能與傳播性增加有關；如何在病毒核酸檢測時快速區分這些突變位點，一直是研究者關注的重要問題。

新冠病毒的遺傳物質為單鏈RNA，相對雙鏈DNA而言更加不穩定，當采樣、核酸提取和保存過程中操作不當，或存在核酸酶、酸、堿等物質時，很容易降解，斷裂為小片段。

目前主流的核酸點突變檢測手段包括探針法熒光定量PCR和測序法。測序法最為準確，但耗時較長，不利于臨床快速檢測；探針法熒光定量PCR檢測RNA病毒上的點突變，首先需要將病毒RNA逆轉錄為cDNA，然后使用一對根據突變位點上下游設計的PCR引物，以及一條覆蓋突變位點的Taqman-MGB熒光探針進行熒光定量PCR；由于Taqman探針需要設計在兩條引物之間，探針法熒光定量PCR需要的模板長度一般不低于100nt，如果病毒核酸在提取和保存過程中受到破壞，碎片化程度較嚴重，則難以檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一組快速檢測新冠病毒S基因點突變的核酸探針，包括檢測新冠病毒S基因N679K突變的鎖式探針PLP-1，超分支滾環擴增引物組RCA-F和RCA-R以及檢測擴增產物所用 sgRNA，所述檢測新冠病毒S基因N679K突變的鎖式探針PLP-1，超分支滾環擴增引物組RCA-F和RCA-R均為單鏈DNA；所述鎖式探針PLP-1的核苷酸堿基序列為SEQ IDNo.1所示，其中5’端具備磷酸化修飾；所述超分支滾環擴增引物組包含2條引物，核苷酸堿基序列分別為為SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。

作為本發明的一種優選技術方案，所述檢測擴增產物所用sgRNA 的核苷酸堿基序列為SEQ ID No.4。

一組快速檢測新冠病毒S基因點突變的核酸探針的方法，具體步驟如下：

步驟一：獲取病毒RNA；

步驟二：以步驟一獲取的RNA為模板，加入鎖式探針PLP-1和連接酶，配制連接反應混合液，進行連接反應；

步驟三：使用超分支滾環擴增引物組RCA-F和RCA-R和具備鏈置換活性的DNA聚合酶對步驟二的反應產物進行滾環擴增反應；

步驟四：檢測擴增產物。

作為本發明的一種優選技術方案，所述步驟二中的連接反應中，所用的連接酶是Splint R ligase。

作為本發明的一種優選技術方案，所述步驟三中的滾環擴增反應中，所用的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶。