[發(fā)明專利]一種家蠶核型多角體病毒多角體的多量高效提取方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210540235.4
• 申請日: 2022-05-17
• 公開（公告）號: CN114736876A
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發(fā)明（設計）人: 范永慧;李繼婭;王永生;劉敏;董占鵬;李濤;邵榆嵐;劉增虎;羅順高;廖鵬飛;李瓊艷;朱紅濤;陳海佺;白紅英;歐秀華;鄧歡
• 申請（專利權）人: 云南省農業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 昆明金科智誠知識產權代理事務所(普通合伙) 53216
• 代理人: 楊釗霞

本發(fā)明公開了一種家蠶核型多角體病毒多角體的多量高效提取方法，包括如下步驟：紗布過濾粗提、離心精提純化、根據(jù)沉淀的不同顏色，分梯度的收集管壁內的乳白色沉淀，小勺去除及純水沖刷等，直至收集液程乳白色，回收液重復該步驟；乳白色多角體液，6000r/min離心10min，去上清液，純水沖刷表面的異色層，收集中間純色的多角體，留存的底部雜質層與表面液又進行離心提純；重復數(shù)次，直至沉淀表面及管壁、管底，無異色，加入適量純水，濃度為1.0?1.5×10⁹個/ml，4℃保存?zhèn)溆?。本發(fā)明采用分梯度紗布過濾，有效提升離心機純化速度；離心提純時不加入其他物質，提取的家蠶核型多角體病毒多角體比較純，可以高效的超多量提取家蠶核型多角體病毒多角體。

技術領域

本發(fā)明涉及病毒(BmNPV)提取技術領域，具體為一種家蠶核型多角體病毒多角體的多量高效提取方法。

背景技術

家蠶BmNPV(Bombyx mori L.Nuclearpolyhedrosis virus，BmNPV)是昆蟲病毒史上首先發(fā)現(xiàn)的病毒.屬于桿狀病毒科；它引起的家蠶BmNPV病(俗稱血液型膿病)是養(yǎng)蠶業(yè)三大病毒病中危害最為嚴重的一種。其傳染性極強，在世界各國蠶區(qū)時有發(fā)生。培育對BmNPV侵染具有高度耐受性的種質資源，進而選育對BmNPV病毒具有高耐受性的家蠶品種，是控制該病對蠶業(yè)生產的危害最經濟有效、安全環(huán)保的手段。

隨著環(huán)境的變化及市場的需求，選育對BmNPV具有高度耐受性的家蠶品種仍然是必要的，所以需要大量的BmNPV。隨著分子生物學的發(fā)展，Bm N PV不再僅僅是家蠶病害，而是漸漸應用到其它領域。目前是作為外源基因高效表達的載體之一，家蠶/Bm N PV表達系統(tǒng)(家蠶生物反應器)已經被認為是目前最有經濟意義的個體表達系統(tǒng)，有基因工程產品“微型發(fā)酵罐”之稱。隨著Bm N PV的應用，其研究也越來越多。因此為了能利用成熟的家蠶飼養(yǎng)技術來大量的生產Bm N PV，尋找一條簡化的而且可以大規(guī)模生產及提純的方法成為當務之急。

發(fā)明內容

針對以上問題，本發(fā)明提供了一種家蠶核型多角體病毒多角體的多量高效提取方法。

根據(jù)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種家蠶核型多角體病毒多角體的多量高效提取方法，包括如下步驟：

S1：紗布過濾粗提

S101：將病毒感染死亡的蠶體收集到收集瓶中，放入4℃冰箱中，靜置一段時間，統(tǒng)一進行紗布過濾；

S102：將收集瓶中的液體倒入過一號濾杯，進行過濾，過濾兩次后，濾液收集在容器中，標記為1號濾液；

S103：倒完液體的收集瓶中加入少量純水，沖洗蠶體表面，將液體繼續(xù)倒入一號濾杯中進行過濾，沖洗3～4次后，將濾液倒入鋪有脫脂棉、一層紗布的二號濾杯進行第二次過濾，及時更換脫脂棉和最上一層紗布，避免脫脂棉及紗布上雜質過多影響過濾效率和濾液質量，收集濾液，標記為2號濾液；

S104：快速搖晃收集瓶，將蠶體殘渣倒入一號濾杯中，扎緊紗布袋，用研磨棒研磨紗布袋，擠壓出液體，通過二號濾杯進行過濾，及時更換脫脂棉和最上一層紗布，收集濾液，標記為3號濾液；

S2：離心精提純化

S201：將1號、2號、3號濾液分別6000r/min離心5min，純水沖洗管壁及沉淀表面細菌及雜質，加入少量純水，振蕩沉淀，使其混勻，分別收集；

S202：將上述處理的2號、3號液，500r/min離心5min，上液合并收集為4號液，肉眼可見雜質、顆粒、沉淀等的收集為5號液，重復2-3次；

S203：1號原液、4號、5號上清50ml或10ml 4號原液加純水至50ml，置于50ml尖底離心管中，6000r/min離心10min，去上清，用特制小勺將表面及管底雜質舀入燒杯中回收，根據(jù)沉淀的不同顏色，分梯度的收集管壁內的乳白色沉淀，小勺去除及純水沖刷等，直至收集液程乳白色；