[發明專利]一種家蠶核型多角體病毒多角體的多量高效提取方法

在審

• 申請號: 202210540235.4
• 申請日: 2022-05-17
• 公開（公告）號: CN114736876A
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發明（設計）人: 范永慧;李繼婭;王永生;劉敏;董占鵬;李濤;邵榆嵐;劉增虎;羅順高;廖鵬飛;李瓊艷;朱紅濤;陳海佺;白紅英;歐秀華;鄧歡
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 昆明金科智誠知識產權代理事務所(普通合伙) 53216
• 代理人: 楊釗霞

1.一種家蠶核型多角體病毒多角體的多量高效提取方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：紗布過濾粗提

S101：將病毒感染死亡的蠶體收集到收集瓶中，放入4℃冰箱中，靜置一段時間，統一進行紗布過濾；

S102：將收集瓶中的液體倒入一號濾杯，進行過濾，過濾兩次后，濾液收集在容器中，標記為1號濾液；

S103：倒完液體的收集瓶中加入少量純水，沖洗蠶體表面，將液體繼續倒入一號濾杯中進行過濾，沖洗3～4次后，將濾液倒入鋪有脫脂棉、一層紗布的二號濾杯進行第二次過濾，及時更換脫脂棉和最上一層紗布，避免脫脂棉及紗布上雜質過多影響過濾效率和濾液質量，收集濾液，標記為2號濾液；

S104：快速搖晃收集瓶，將蠶體殘渣倒入一號濾杯中，扎緊紗布袋，用研磨棒研磨紗布袋，擠壓出液體，通過二號濾杯進行過濾，及時更換脫脂棉和最上一層紗布，收集濾液，標記為3號濾液；

S2：離心精提純化

S201：將1號、2號、3號濾液分別6000r/min離心5min，純水沖洗管壁及沉淀表面細菌及雜質，加入少量純水，振蕩沉淀，使其混勻，分別收集；

S202：將上述處理的2號、3號液，500r/min離心5min，上液合并收集為4號液，肉眼可見雜質、顆粒、沉淀等的收集為5號液，重復2-3次；

S203：1號原液、4號、5號上清50ml或10ml 4號原液加純水至50ml，置于50ml尖底離心管中，6000r/min離心10min，去上清，用特制小勺將表面及管底雜質舀入燒杯中回收，根據沉淀的不同顏色，分梯度的收集管壁內的乳白色沉淀，小勺去除及純水沖刷等，直至收集液程乳白色；

S204：回收液上清50ml或搖勻下部液10ml加純水至50ml，重復數次S203步驟，收集夠多的多角體；

S205：乳白色多角體液，6000r/min離心10min，去上清液，純水沖刷表面的異色層，收集中間純色的多角體，留存的底部雜質層與表面液又進行離心提純；重復數次，直至沉淀表面及管壁、管底，無異色，加入適量純水，濃度為1.0-1.5×10⁹個/ml，4℃保存備用。

2.根據權利要求1所述的一種家蠶核型多角體病毒多角體的多量高效提取方法，其特征在于，S1中，用紗布袋套入燒杯中制成的簡易過濾杯為一號濾杯；一號濾杯口鋪上脫脂棉及一層紗布制成的簡易過濾杯為二號濾杯。

3.根據權利要求1所述的一種家蠶核型多角體病毒多角體的多量高效提取方法，其特征在于，S104中，將蠶體殘渣倒入一號濾杯中絲腺等不溶物不倒入。

4.根據權利要求1所述的一種家蠶核型多角體病毒多角體的多量高效提取方法，其特征在于，6000r/min離心10min所用的50ml離心管必須是尖底的，避免圓(弧)底離心管造成沉淀斷層影響分梯度收集乳白色沉淀。

5.根據權利要求1所述的一種家蠶核型多角體病毒多角體的多量高效提取方法，其特征在于，S204中多角體如果不夠，5號的下部溶液重復S202、S203和S204，收集更多的BmNPV多角體。