[發明專利]一種快速獲得蘿卜轉基因材料的方法

有效

• 申請號: 202210536365.0
• 申請日: 2022-05-20
• 公開（公告）號: CN114958904B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發明（設計）人: 王燕;王爽;易小芳;應佳麗;董俊輝;柳李旺;徐良
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06;A01H6/20;C12N15/10
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• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種快速獲得蘿卜轉基因材料的方法，包括：對蘿卜種子進行消毒種植無菌苗；活化攜帶目的基因的發根農桿菌；制備侵染液；獲取無根苗外植體并浸入菌液進行侵染；經過共培養和脫菌培養30d后，通過表型篩選、PCR檢測和qRT?PCR分析鑒定陽性毛狀根；切取陽性毛狀根放置于愈傷組織培養基上誘導愈傷組織，獲得轉基因愈傷組織。本發明提高了發根農桿菌誘導蘿卜毛狀根的效率，縮短了發根時間，成功誘導了轉基因愈傷組織，能夠進行蘿卜部分本體基因功能驗證。

技術領域

本發明屬于蘿卜轉基因體系技術領域，涉及發根農桿菌介導的蘿卜遺傳轉化體系的建立方法，以及以轉基因毛狀根為外植體獲得轉基因愈傷組織方法的優化。

背景技術

蘿卜(Raphanus sativus L.)為十字花科蘿卜屬一、二年生草本植物，營養豐富，食療保健價值高，在我國蔬菜生產和周年供應中占有重要地位。目前，隨著蘿卜基因組序列的公布以及轉基因工程等現代生物技術的快速發展，給蘿卜種質遺傳改良提供了新的思路和選擇。發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)可通過Ri質粒誘導植物產生生理性狀和遺傳性穩定的毛狀根，同時將外源基因共同整合到植物基因組中，從而實現目的基因的遺傳轉化。發根農桿菌介導的遺傳轉化具有周期短、操作簡單和應用范圍廣等優點，已成為植物基因功能驗證和根系生物學研究的有力工具。然而，目前尚未見對發根農桿菌介導蘿卜遺傳轉化的影響因素進行綜合分析的研究報道，沒有建立高效的轉化體系。通過發根農桿菌誘導蘿卜產生不定根，提高了轉化的效率，能夠進行部分基因功能在蘿卜本體中的驗證。

發明內容

本發明提供了一種快速獲得蘿卜轉基因毛狀根和以毛狀根為外植體誘導轉基因愈傷組織的體系，為蘿卜基因功能的驗證提供了有效方法。與其他的瞬時轉化和異源轉化相比，發根農桿菌介導的遺傳轉化體系更便捷、穩定。

本發明的具體技術方案如下：

一種快速獲得蘿卜轉基因材料的方法，包括以下步驟：

(1)對蘿卜種子進行消毒，將消毒后的種子播種到滅菌的MS培養基上獲得無菌苗。

(2)活化攜帶目的基因的發根農桿菌。

(3)侵染無菌苗的前一天使用LB液體培養基搖菌。

(4)待無菌苗生長到6-7d時，切除實生根獲得無根苗，使用步驟(3)中的菌液侵染無根苗。

(5)侵染后的植株在無菌濾紙上晾干，隨后接種到MS培養基上共培養2d。

(6)共培養結束后，將植株轉移到脫菌培養基上進行培養。

(7)培養30d后，對發出的毛狀根進行表型鑒定，提取DNA和RNA進行PCR檢測和qRT-PCR分析，檢測目的基因是否成功轉入毛狀根并過量表達。

(8)以轉基因毛狀根為外植體誘導轉基因愈傷組織。

所述的發根農桿菌為MSU440菌株，屬于農桿堿型發根農桿菌。

步驟(1)中，采用75％的乙醇消毒1.5min，8％的次氯酸鈉消毒10min，無菌水沖洗3次，在無菌濾紙上晾干，完成種子滅菌過程。

步驟(2)中，攜帶目的基因的發根農桿菌菌液保存在-80℃冰箱中，使用LB固體培養基進行活化；

所述的LB固體培養基為：在每升的LB培養基中添加100mg/L卡那霉素(Kan)+50mg/L鏈霉素(Str)+15g/L瓊脂。

步驟(2)中，使用滅菌槍頭吸取20μL菌液，在LB固體培養基上劃線后密封，倒置于28℃恒溫培養箱培養2d，待菌落長出。

步驟(3)中，使用滅菌槍頭刮取菌落轉移到LB液體培養基中，于28℃，220rmp恒溫搖床培養8-12h。