[發明專利]一種快速獲得蘿卜轉基因材料的方法

有效

• 申請號: 202210536365.0
• 申請日: 2022-05-20
• 公開（公告）號: CN114958904B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發明（設計）人: 王燕;王爽;易小芳;應佳麗;董俊輝;柳李旺;徐良
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06;A01H6/20;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種快速獲得蘿卜轉基因材料的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)對蘿卜種子進行消毒，接種到MS培養基上，獲得無菌苗；

(2)攜帶目的基因的發根農桿菌菌液活化與侵染液制備；

(3)外植體制備與侵染；

(4)共培養、脫菌培養及毛狀根誘導；

(5)根據表型或載體熒光標記篩選轉基因毛狀根；

(6)DNA、RNA提取和反轉錄，PCR檢測和qRT-PCR分析；

(7)將轉基因毛狀根切成0.5em的小段接種至愈傷組織培養基上誘導轉基因愈傷組織。

2.如權利要求1所述的一種快速獲得蘿卜轉基因材料的方法，其特征在于：步驟(1)中，消毒方式為采用75％的酒精消毒1.5min，8％次氯酸鈉消毒10min，隨后用無菌水沖洗3次；MS培養基成分為：41.74g/L MS(含瓊脂(Agar)和蔗糖(Sucrose))；無菌苗于25℃，光照時長為16h/d的條件下培養。

3.如權利要求1所述的一種快速獲得蘿卜轉基因材料的方法，其特征在于：步驟(2)中含有目的基因的發根農桿菌菌液保存在-80℃冰箱中，活化農桿菌的培養基為：20g/L LB+15g/L瓊脂+100mg/L卡那霉素(Kanamycin，Kan)+50mg/L鏈霉素(Streptomycin sulfate，Str)；搖菌時培養基為：20g/L LB+100mg/L Kan+50mg/L Str；侵染液制備時，采用1/2MS液體培養基，將菌液OD₆₀₀值調節至1.0，菌液中添加300μmol/L的乙酰丁香酮(AS)，侵染過程在28℃，220rmp搖床中進行；1/2MS液體培養基的成分為4.6g/L 1/2MS+30g/L蔗糖。

4.如權利要求1所述的一種快速獲得蘿卜轉基因材料的方法，其特征在于：步驟(3)中取6-7d苗齡無菌苗，從生長點向下1cm處快速切斷獲得無根苗外植體，將無根苗浸入OD₆₀₀＝1.0的菌液中侵染10min，用無菌水沖洗3次，隨后在無菌濾紙上完全晾干。

5.如權利要求1所述的一種快速獲得蘿卜轉基因材料的方法，其特征在于：步驟(4)中共培養培養基為41.74g/L MS培養基，共培養在黑暗條件下進行，時間為2d，；脫菌培養基為41.74g/L MS+300mg/L頭孢噻肟霉素(Cef)，脫菌培養30d左右。

6.如權利要求1所述的一種快速獲得蘿卜轉基因材料的方法，其特征在于：步驟(6)提取DNA的方法為CTAB法；DNA檢測的PCR反應體系如下：總體積為10μL，其中Taq酶Mix 5μL、引物F(10μM)和引物R(10μM)各0.5μL、模板DNA(20ng/μL)1μL、ddH₂O 3μL。

PCR反應程序：

7.如權利要求1所述的一種快速獲得蘿卜轉基因材料的方法，其特征在于：步驟(6)中RNA提取與反轉錄方法參照總RNA提取試劑盒(RNAsimple Total RNA Kit)和反轉錄試劑盒(Reverse Transcription Kit)。qRT-PCR反應體系如下：體系為15μL，其中，2×SYBR greenreaction mix 7μL，引物F(10μM)和引物R(10μM)各0.56μL，cDNA(20ng/μL)，ddH₂O 3μL。

qRT-PCR反應程序：

8.如權利要求1所述的一種快速獲得蘿卜轉基因材料的方法，其特征在于：步驟(7)中愈傷誘導培養基成分為：41.74g/L MS(含瓊脂(Agar)和蔗糖(Sucrose))+0.75mg/L噻二唑苯基脲(TDZ)+0.5mg/L萘乙酸(NAA)+300mg/L Cef。