[發明專利]一種用于檢測鰤諾卡氏菌的RPA引物、探針以及檢測方法

有效

• 申請號: 202210535699.6
• 申請日: 2022-05-18
• 公開（公告）號: CN114634990B
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發明（設計）人: 譚愛萍;涂傳明;鄧玉婷;趙飛;黃志斌
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所;廣州奕昕生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/365
• 代理公司: 廣州專理知識產權代理事務所(普通合伙) 44493
• 代理人: 張鳳

本發明屬于生物檢測的技術領域，具體涉及一種用于檢測鰤諾卡氏菌的RPA引物、探針以及檢測方法。所述RPA引物中引物F和R的核酸序列分別如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探針的核酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。本發明的用于檢測鰤諾卡氏菌的RPA引物和探針，從臨床判斷為感染或疑似感染鰤諾卡氏菌組織中快速準確地檢測岀鰤諾卡氏菌，該方法體現出較強的特異性，以及其檢測靈敏度均較常規PCR更高，檢測限度達到60 pg/μL，還可以對不同來源的鰤諾卡氏菌進行檢測，這對鰤諾卡氏菌病的早期診斷、早期治療等方面具有重要意義，同時還可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。

技術領域

本發明屬于生物檢測的技術領域，具體涉及一種用于檢測鰤諾卡氏菌的RPA引物、探針以及檢測方法。

背景技術

鰤諾卡氏菌（Nocardia seriolae）是革蘭氏陽性絲狀桿菌，屬于放線菌目（Actinomycetales）、諾卡氏菌科（Nocardiaceae）、諾卡氏菌屬（Nocardia），1967年在日本五條鰤（Seriola quinqueradiata）中首次分離發現，隨后陸續在北美、歐洲、大洋洲的多種海水和淡水魚類中被報道。該菌宿主范圍廣，已在多種魚類如大黃魚（Larimichthys crocea）、烏鱧（Channa argus）、大口黑鱸（Micropterus salmoniodes）暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）、羅非魚(Tilapia mossambica)、招財魚(Osphronemus goramy)等發現。鰤諾卡氏菌感染在環境溫度為25~28℃時發病最嚴重，氣溫下降后發病情況有所緩解，該病菌感染持續時間長，病魚前期無明顯癥狀，中期開始表現出少食、反應遲緩等癥狀，后期出現體表潰爛出血、肛門紅腫、腹部腫大，病魚肝、脾、腎、肌肉等出現大量肉眼可見的白色結節等臨床表現，從發病到死亡需要2周左右，自然發病率為35~60%，如能早期診斷、早期治療常可控制或痊愈，否則會很難治療甚至出現大量死亡，是目前影響加州鱸和烏鱧養殖產業健康持續發展的主要病害，每年因該病帶來的經濟損失也非常大。因此，開發鰤諾卡氏菌的早期快速檢測技術，對鰤諾卡氏菌病早期診斷、早期治療具有重要的意義。

現有的鰤諾卡氏菌病檢測方法主要有傳統生理生化鑒定方法和分子生物學方法，其中傳統生理生化鑒定方法包括采用生化管鑒定或采用微生物鑒定系統；分子生物學方法包括普通PCR和熒光定量PCR方法，上述方法有的耗時長，有的需要昂貴的設備，有的檢測靈敏度不夠高或者容易出現假陽性現象，因此研發靈敏、快速的檢測方法是本領域不斷探索的課題。

鰤諾卡氏菌是一種生長緩慢的革蘭氏陽性菌，生長周期為3~7天，因此傳統生理生化鑒定方法不適合進行諾卡氏菌的快速檢測。例如，普通PCR操作繁瑣、交叉污染的風險較高，檢測時間也較長，一般需要1~1.5 h，不適合鰤諾卡氏菌的快速檢測；熒光定量PCR方法的絕對定量依賴于Ct值和標準曲線，對于低拷貝的靶基因或模板差異倍速不大的情況下，該技術的檢測敏感性和精確度會受限制；LAMP方法需要使用的引物多達4~6條，對擴增的目的基因片段的特異性要求非常高，增加了污染風險，容易出現假陽性的情況；以及RAA方法，擴增后需要通過凝膠電泳觀察結果，均不利于現場的快速檢測。

發明內容

針對上述問題，本發明的目的在于提供一種用于檢測鰤諾卡氏菌的RPA引物、探針以及檢測方法。

本發明的技術內容如下：

本發明提供了一種用于檢測鰤諾卡氏菌的RPA引物，所述RPA引物為基于陳國權等（“魚類鰤魚諾卡氏菌特異性PCR檢測方法的建立”2020）報道的鰤諾卡氏菌特異性序列設計得到，所述引物F和R的核酸序列分別如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；