[發(fā)明專(zhuān)利]一種酶活提高的雙果糖酐水解酶突變體E389A

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210526090.2
• 申請(qǐng)日: 2022-05-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114807092B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郁書(shū)懷;徐寒冰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/24
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/14;C12P19/12;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發(fā)明公開(kāi)了一種酶活提高的雙果糖酐水解酶突變體E389A，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明對(duì)氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的雙果糖酐水解酶的第389位氨基酸定點(diǎn)突變，得到雙果糖酐水解酶突變體E389A。本發(fā)明提供的雙果糖酐水解酶E389A的最適pH為6.5，最適反應(yīng)溫度為55℃，酶活和催化效率相比野生酶分別提高了3.6倍和4倍。對(duì)氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的雙果糖酐水解酶的第389位氨基酸定點(diǎn)突變提高了雙果糖酐水解酶的生產(chǎn)能力和催化效率，為工業(yè)中菊二糖生產(chǎn)提供了優(yōu)良催化劑，有助于降低生產(chǎn)成本，為菊二糖的研究奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酶活提高的雙果糖酐水解酶突變體E389A，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

果聚糖在自然界中普遍存在，是一種由果糖基連接成的碳水化合物的總稱(chēng)。果聚糖不僅存在于雙子葉植物中，可以提高植物的耐旱能力，起到液泡滲透緩沖劑和低溫保護(hù)劑的作用。果聚糖也大量存在于細(xì)菌和真菌中用以保護(hù)細(xì)胞和防止失水。

自然界中存在兩種果聚糖，按照果糖基之間糖苷鍵的差異，可分為β-(2，1)鍵連接的菊糖和β-(2，6)鍵連接的Levan果聚糖。Levan果聚糖在自然界中含量極少，而菊糖大量存在于菊科植物中，價(jià)格比較便宜，作為一種益生元和膳食纖維應(yīng)用比較廣泛。

菊糖其中一條代謝途徑是先通過(guò)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶被轉(zhuǎn)化成為益生元雙果糖酐。雙果糖酐在人體上消化道中不被消化吸收，到達(dá)大腸后被腸道微生物中的雙果糖酐水解酶水解為菊二糖，菊二糖進(jìn)一步被微生物果糖苷酶水解成為果糖而被人體吸收利用。另一條途徑是通過(guò)菊粉酶將菊糖轉(zhuǎn)化為低聚果糖，低聚果糖里包括果糖，菊二糖，菊三糖，菊四糖等混合物，具有重要的生理功能。這兩條途徑都有菊二糖生成，而且對(duì)菊糖、雙果糖酐、果糖的研究較為透徹，但是對(duì)于菊二糖的研究較少，其生理功能未有相關(guān)報(bào)道，理化性質(zhì)研究也鮮有報(bào)道。基于其他糖都具有重要生理功能，推測(cè)菊二糖也是一種功能糖。市場(chǎng)上并無(wú)菊二糖純樣品出售，這可能限制了生產(chǎn)和性質(zhì)研究，而且菊二糖的合成主要是利用雙果糖酐水解酶水解獲得。但雙果糖酐水解酶活力較低，因此，篩選新的酶或者理性設(shè)計(jì)改造現(xiàn)有的雙果糖酐水解酶使其能夠高效生產(chǎn)菊二糖就十分必要。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)對(duì)微生物Arthrobacter?chlorophenolicusA6來(lái)源的雙果糖酐水解酶進(jìn)行分子改造，獲得酶活和催化效率都顯著提高的雙果糖酐水解酶突變體。

本發(fā)明提供了一種雙果糖酐水解酶突變體，所述突變體是在Arthrobacterchlorophenolicus?A6來(lái)源的雙果糖酐水解酶的基礎(chǔ)上將第389位谷氨酸突變?yōu)楸彼帷?/p>

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述微生物Arthrobacter?chlorophenolicusA6來(lái)源的雙果糖酐水解酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

本發(fā)明提供了編碼所述雙果糖酐水解酶突變體的基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

本發(fā)明提供了攜帶所述基因的重組載體。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組載體包括但不限于pET系列質(zhì)粒。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組載體以pET-22b(+)為表達(dá)載體。

本發(fā)明提供了攜帶所述基因或所述重組載體的微生物細(xì)胞。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述微生物細(xì)胞以細(xì)菌或真菌為表達(dá)宿主。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述微生物細(xì)胞以大腸桿菌為表達(dá)宿主。