[發明專利]D-賴氨酸衍生物構筑的細菌細胞壁新生肽聚糖的生物發光檢測體系及應用方法

在審

• 申請號: 202210525034.7
• 申請日: 2022-05-14
• 公開（公告）號: CN115372341A
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 孫金玉;宋英壯;徐芷靜
• 申請（專利權）人: 西北工業大學深圳研究院
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;C12Q1/04;C07C247/18;C07F9/6541;C09K11/06
• 代理公司: 西安凱多思知識產權代理事務所(普通合伙) 61290
• 代理人: 王鮮凱

本發明涉及一種D?賴氨酸衍生物構筑的細菌細胞壁新生肽聚糖的生物發光檢測體系及應用方法，體系包括D?熒光素衍生物和D?賴氨酸衍生物。本發明所涉及的熒光素衍生物和氨基酸衍生物，合成方法簡單，可以實現利用生物發光技術檢測細菌細胞壁中的新生肽聚糖，以及在小鼠體內對細菌進行生物發光檢測。合成方法簡單，可以利用熒光素酶，在細菌、小鼠活體中對細胞壁中的新生肽聚糖進行檢測。識別不會受到環境中共存離子的干擾，具有非常高的選擇性。可以與熒光素衍生物發生特異性點擊反應，利用熒光素酶進行生物發光檢測，具有高靈敏度、特異性和組織穿透力。

技術領域

本發明涉及一種D-賴氨酸衍生物構筑的細菌細胞壁新生肽聚糖的生物發光檢測體系及應用方法。

背景技術

細菌細胞壁由膜層和一種稱為肽聚糖的剛性而柔軟的支架組成。肽聚糖提供機械強度，使細菌能夠抵抗環境的破壞和因內部膨脹而產生的溶解。肽聚糖在維持細菌細胞形態方面也起著關鍵作用。肽聚糖對于細菌繁殖作用、以及作為抗生素靶標的價值，引起了人們對肽聚糖生物合成研究的新興趣。然而，在對肽聚糖的合成和動力學有一個清晰的了解之前，仍然存在著重大的知識缺口須加以解決。熒光分子探針和成像技術的出現大大推進了肽聚糖合成和修飾的研究。然而，由于熒光分子探針檢測需要外源激發光激發，使成像背景信號高，且熒光成像光漂白嚴重，組織穿透力差，很難對活體進行有效檢測。

生物發光檢測技術方法簡單、信噪比高、組織穿透力強、靈敏度高，已成為發展快速檢測各種物種的有效手段之一。目前，關于肽聚糖的檢測的熒光探針化合物已經有諸多報道，但還沒有利用生物發光探針對細菌、活體肽聚糖進行檢測的報道。因此，設計一種生物發光探針對細菌細胞壁肽聚糖進行檢測顯然具有重要價值。

發明內容

要解決的技術問題

為了避免現有技術的不足之處，本發明提出一種D-賴氨酸衍生物構筑的細菌細胞壁新生肽聚糖的生物發光檢測體系，提供一種細菌細胞壁新生肽聚糖的生物發光檢測體系的制備方法，以及用于細菌、活體對肽聚糖進行檢。

技術方案

一種D-賴氨酸衍生物構筑的細菌細胞壁新生肽聚糖的生物發光檢測體系，其特征在于：體系包括D-熒光素衍生物和D-賴氨酸衍生物的混合物。

所述D-熒光素衍生物和D-賴氨酸衍生物的比例范圍為1:1～20。

一種所述體系中的D-賴氨酸衍生物，其特征在于結構式為：

一種所述D-賴氨酸衍生物的制備方法，其特征在于步驟如下：

步驟1：將4-疊氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸置于二氯甲烷中，室溫下逐滴滴加草酰氯，加入催化量的DMF，室溫攪拌1～12h，蒸干得到粗品4-疊氮-2,3,5,6-四氟苯甲酰；

所述4-疊氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸與草酰氯摩爾比1:2；

步驟2：將粗品4-疊氮-2,3,5,6-四氟苯甲酰氯溶解于干燥的四氫呋喃中，并將其滴加至到N-(叔丁氧羰基)-D-賴氨酸、碳酸氫鉀水溶液中；室溫攪拌過夜，濃縮以去除四氫呋喃；

所述4-疊氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸與N-(叔丁氧羰基)-D-賴氨酸摩爾比1:2，4-疊氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸與碳酸氫鉀摩爾比1:2-5；

步驟3：柱層析分離步驟2得到的中間體，將其溶于少量乙酸乙酯中，加入飽和氯化氫乙酸乙酯溶液脫Boc，此時有白色固體析出，過濾收集白色固體得到D-賴氨酸衍生物DAz。

一種所述體系中的D-熒光素衍生物，其特征在于：所述D-熒光素衍生物結構式為：

一種所述D-熒光素衍生物的制備方法，其特征在于步驟如下：