[發(fā)明專利]一種試劑組、試劑盒及利用其進(jìn)行免疫檢測(cè)的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210521009.1
• 申請(qǐng)日: 2022-05-12
• 公開（公告）號(hào): CN114965983A
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王小慧;林巍靖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海云澤生物科技有限公司;上海健耕醫(yī)藥科技股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/531
• 分類號(hào): G01N33/531;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 上海弼興律師事務(wù)所 31283
• 代理人: 呂學(xué)辰;黃益澍

本發(fā)明公開了一種試劑組、試劑盒及利用其進(jìn)行免疫檢測(cè)的方法。還公開了一種膠乳增強(qiáng)免疫比濁法試劑的制備方法，其包括以下步驟：將大粒徑和小粒徑膠乳微球分別活化后，將抗待測(cè)物的抗體加入大粒徑膠乳微球中，待測(cè)物蛋白復(fù)合物加入小粒徑膠乳微球中，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)；反應(yīng)液分別經(jīng)封閉、離心、復(fù)溶和重懸后，即得包含抗體偶聯(lián)的大粒徑膠乳微球的R1試劑，和，包含待測(cè)物偶聯(lián)的小粒徑膠乳微球的R2試劑。本發(fā)明的試劑盒包括：所述R1試劑、R2試劑和校準(zhǔn)品。本發(fā)明充分發(fā)揮了不同粒徑膠乳微球的優(yōu)勢(shì)，極好地克服了現(xiàn)有方法存在的低值靈敏度和檢測(cè)線性范圍無法兼顧的問題，具有測(cè)值準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單、快速，可用于門急診檢測(cè)且儀器適用面廣等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，涉及一種試劑組、試劑盒及利用其進(jìn)行免疫檢測(cè)的方法。

背景技術(shù)

膠乳增強(qiáng)免疫比濁法(Latex enhanced turbidimetric immunoassay，LETIA)通過共價(jià)偶聯(lián)或物理吸附等方式，將抗體或抗原偶聯(lián)到納米尺寸的膠乳微球表面，形成膠乳微球-抗體或膠乳微球-抗原復(fù)合物。所述復(fù)合物與樣本中的待測(cè)抗原或待測(cè)抗體高度特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，使膠乳微球表面的抗體或抗原與標(biāo)本所含的待測(cè)物反應(yīng)而形成微球聚集體，在反應(yīng)過程中起到增強(qiáng)信號(hào)的作用，可以將檢測(cè)的靈敏度提高好幾個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到準(zhǔn)確的定量效果。

膠乳增強(qiáng)免疫比濁可采用競(jìng)爭(zhēng)法和非競(jìng)爭(zhēng)法兩種模式，競(jìng)爭(zhēng)法可用于大分子待測(cè)物，也可用于小分子待測(cè)物，而非競(jìng)爭(zhēng)法一般僅用于檢測(cè)含有多個(gè)抗原表位的蛋白類待測(cè)物。小分子待測(cè)物由于分子量的限制，一般難以建立非競(jìng)爭(zhēng)免疫比濁檢測(cè)方法，而只有采用競(jìng)爭(zhēng)免疫比濁的方式實(shí)施檢測(cè)。競(jìng)爭(zhēng)法膠乳增強(qiáng)比濁法是指樣本所含待測(cè)物與檢測(cè)體系固定量的待測(cè)物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合限量的抗待測(cè)物抗體，使免疫反應(yīng)體系在某特定波長(zhǎng)下的吸光值(A)發(fā)生變化，通過測(cè)定該變化計(jì)算樣本中小分子待測(cè)物的濃度，達(dá)到疾病診斷、篩查、監(jiān)測(cè)等臨床目的。

膠乳免疫比濁試劑中，靈敏度高低，直觀的表現(xiàn)為吸光度信號(hào)值變化率高低及其測(cè)試重復(fù)穩(wěn)定性，可以間接的通過最低檢測(cè)限(Limit of Detection，簡(jiǎn)稱LOD)來表述，即LOD越低，靈敏度越高。而線性范圍是指按說明書使用可準(zhǔn)確測(cè)量的范圍，是衡量試劑盒質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是保證使用和鑒定試劑盒的關(guān)鍵指標(biāo)之一。

表面帶有羧基官能團(tuán)的聚苯乙烯(PS)納米膠乳微球是LETIA試劑常用的載體，目前市售的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法試劑主要是用單一粒徑膠乳微球。選擇粒徑小的膠乳微球，微球的蛋白載量大，可以偶聯(lián)更多的免疫結(jié)合試劑，往往可以獲得更寬的待測(cè)物測(cè)量濃度范圍，精密度和線性相對(duì)較好，檢測(cè)的線性范圍可覆蓋高值區(qū)域。然而，小粒徑微球的凝集導(dǎo)致的A值增量相對(duì)較小，檢測(cè)靈敏度也相應(yīng)較低，對(duì)于樣本中含量極微的待測(cè)物，尤其是對(duì)于樣本中含量極微且需要采用競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方式檢測(cè)的小分子待測(cè)物，使用小粒徑微球常常難以實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)，測(cè)值不準(zhǔn)確，變異系數(shù)(CV)值過大。而選擇粒徑大的微球，所需的抗體量較少，能夠有效增加吸光度信號(hào)值，成倍提高試劑靈敏度，有利于低值的檢測(cè)以達(dá)到靈敏度的要求，但是會(huì)導(dǎo)致試劑空白過高，精密度和線性相對(duì)較差，微球檢測(cè)的線性范圍不夠，因此高值檢測(cè)不準(zhǔn)確，而且大粒徑膠乳通常會(huì)降低試劑線性范圍和抗原過剩能力，且大粒徑膠乳生產(chǎn)工藝更難控制。

發(fā)明內(nèi)容

為克服現(xiàn)有技術(shù)的膠乳增強(qiáng)免疫法存在低值靈敏度和檢測(cè)線性范圍無法兼顧的問題，本發(fā)明提供了一種提高膠乳增強(qiáng)免疫比濁法線性范圍和靈敏度的方法，該方法選用兩種平均粒徑不同的羧基化膠乳微粒，利用化學(xué)交聯(lián)法使兩種不同粒徑大小的熒光微球同時(shí)偶聯(lián)抗原復(fù)合物和抗體，充分發(fā)揮不同粒徑膠乳微球的優(yōu)勢(shì)，極好地克服了膠乳增強(qiáng)免疫法存在的低值靈敏度和檢測(cè)線性范圍無法兼顧的問題。本發(fā)明還提供一種具有高靈敏度和寬線性范圍的試劑及試劑盒，其包括：試劑1(R1)、試劑2(R2)和校準(zhǔn)品，具有測(cè)值準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單、快速，可用于門急診檢測(cè)且儀器適用面廣等優(yōu)點(diǎn)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明使用的技術(shù)方案之一為：一種膠乳增強(qiáng)免疫比濁法試劑的制備方法，所述方法包括以下步驟：