[發(fā)明專利]一種殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列的應(yīng)用及釀酒酵母孢子固定化酶的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210519240.7
• 申請日: 2022-05-12
• 公開（公告）號: CN114908115B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李子杰;高曉冬;李婉杰;許向陽;宋在偉
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué);棗莊市杰諾生物酶有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N11/16;C12N11/18;C12N9/40;C12N9/24;C12R1/865
• 代理公司: 南京禹為知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32272
• 代理人: 康偉

本發(fā)明公開了一種殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列的應(yīng)用及釀酒酵母孢子固定化酶的方法，所述應(yīng)用為利用所述殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列在釀酒酵母孢子固定化酶中的應(yīng)用，所述殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明首次選擇來源于Paenibacilus sp.IK?5殼聚糖酶的殼聚糖結(jié)合區(qū)域CBM32作為運載蛋白，利用CBM32與dit1Δ孢子壁殼聚糖層的親和能力，實現(xiàn)酶蛋白在dit1Δ孢子中的固定化；本發(fā)明解決了以往孢子固定化酶活性低，重復(fù)使用能力差的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于固定化酶技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列的應(yīng)用及釀酒酵母孢子固定化酶的方法。

背景技術(shù)

二倍體釀酒酵母營養(yǎng)細胞在以醋酸鹽為唯一碳源，并缺乏氮源的條件下，會進入減數(shù)分裂階段形成四個單倍體的子囊孢子，經(jīng)自然或人為破壁后，獲得單個游離孢子。孢子壁有四層結(jié)構(gòu)，從內(nèi)到外依次為甘露糖層、葡聚糖層、殼聚糖層以及二酪氨酸層。酵母孢子固定化酶是基于孢子壁的特殊結(jié)構(gòu)，以孢子作為一種固定化的生物材料，將酶表達或固定在孢子壁上。由于殼聚糖層對蛋白的交聯(lián)作用及致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)二酪氨酸層的攔截作用，在酵母孢子中表達分泌蛋白或帶有分泌型信號肽的非分泌蛋白時，蛋白會被固定在殼聚糖層和二酪氨酸層之間，從而形成了孢子“微膠囊”固定化酶。

本發(fā)明使用一種釀酒酵母缺陷型菌株dit1Δ，該菌株缺失二酪氨酸層，其最外層為殼聚糖層。dit1Δ孢子作為一種生物固定化酶材料，在產(chǎn)孢的同時將酶蛋白展示在表面，經(jīng)研究表明，dit1Δ孢子固定化酶的活性最高，但經(jīng)反復(fù)使用后其酶活下降較快，不宜重復(fù)使用。因此，如何提高dit1Δ缺陷型釀酒酵母孢子固定化酶的活性及重復(fù)利用性依然是一個重大挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本部分的目的在于概述本發(fā)明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。

鑒于上述和/或現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提出了本發(fā)明。

本發(fā)明的其中一個目的是提供一種殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列的應(yīng)用，。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一種殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列在釀酒酵母孢子固定化酶中的應(yīng)用，所述殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作為本發(fā)明殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列在釀酒酵母孢子固定化酶中的應(yīng)用的一種優(yōu)選方案，其中：所述殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列來源于Paenibacilus sp.IK-5殼聚糖酶的殼聚糖結(jié)合區(qū)域。

作為本發(fā)明殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列在釀酒酵母孢子固定化酶中的應(yīng)用的一種優(yōu)選方案，其中：所述在釀酒酵母孢子固定化酶中的應(yīng)用，利用所述殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列與釀酒酵母孢子壁殼聚糖層的親和能力，將目的酶與所述殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列融合表達在釀酒酵母孢子中。

作為本發(fā)明殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列在釀酒酵母孢子固定化酶中的應(yīng)用的一種優(yōu)選方案，其中：所述釀酒酵母孢子為釀酒酵母缺陷型菌株dit1Δ的孢子。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種釀酒酵母孢子固定化酶的方法，包括，

將目的酶基因構(gòu)建在含有如權(quán)利要求1所述的殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列的表達質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒；

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母缺陷型菌株dit1Δ中，得到酵母菌株；

對得到的酵母菌株利用二倍體酵母誘導(dǎo)產(chǎn)孢得到孢子固定化目的酶。

作為本發(fā)明釀酒酵母孢子固定化酶的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述目的酶基因為α-半乳糖苷酶基因。

作為本發(fā)明釀酒酵母孢子固定化酶的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述表達質(zhì)粒為釀酒酵母質(zhì)粒pRS426。