[發(fā)明專利]茶樹(shù)黃酮醇類合成候選基因CsNAC086及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210508205.5
• 申請(qǐng)日: 2022-05-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115197951B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李春芳;宋灑灑;高瓏瀚;陶玉;曹清海;黃素亞;劉寧鴿
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N15/29;C12N15/64;C12N15/82;C12N15/84;A01H5/00;A01H5/02;A01H6/82
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;黃競(jìng)云

1.一種茶樹(shù)NAC轉(zhuǎn)錄因子在構(gòu)建過(guò)表達(dá)黃酮醇的植株中的應(yīng)用，其特征在于：所述茶樹(shù)NAC轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示;所述植株為煙草。

2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述茶樹(shù)NAC轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因如SEQ?IDNO：1所示。

3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于：以所述茶樹(shù)NAC轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，得到重組基因工程菌。

4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述重組質(zhì)粒的載體為pCAMBIA2300載體。

5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組質(zhì)粒按如下方法構(gòu)建：

（1）以從Camellia?sinensis?CV.?Zijuan新梢葉片提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以所述cDNA為模板，通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到茶樹(shù)NAC轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因：pCAMBIA2300-CsNAC086-F：5’-ATGGCACCTGTTTCGTTGCC-3’，

pCAMBIA2300-CsNAC086-R：5’-CTATGGGGAATTAGGTGCAATATGC-3’；

（2）用限制性內(nèi)切酶BamH?I與Sal?I對(duì)?pCAMBIA2300載體進(jìn)行雙酶切，得到線性化載體；以ClonExpress???II?One?Step?Cloning?Kit對(duì)步驟（1）所述茶樹(shù)NAC轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因和所述線性化載體進(jìn)行一步克隆，以所得一步克隆的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含卡那霉素的培養(yǎng)基篩選和測(cè)序驗(yàn)證后，挑選陽(yáng)性克隆培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，即得到所述重組質(zhì)粒。

6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組基因工程菌按如下方法構(gòu)建：熱激法將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含所述重組質(zhì)粒的載體所攜帶的抗性基因指向的抗生素的YEB固體培養(yǎng)基篩選，菌落PCR檢驗(yàn)，得到所述重組基因工程菌。

7.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述過(guò)表達(dá)黃酮醇的植株按如下方法構(gòu)建：

將本氏煙草Nicotiana?benthamiana無(wú)菌苗上部完全展開(kāi)的幼嫩葉片裁剪成小塊浸泡于所述重組基因工程菌的菌液中10?min，所述重組基因工程菌的菌液的OD₆₀₀為0.6；取出葉片后，轉(zhuǎn)移無(wú)菌濾紙上吸干液體，然后于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上28℃暗培養(yǎng)三天；然后轉(zhuǎn)入出芽選擇培養(yǎng)基中在28℃的培養(yǎng)溫度下按照光照16?hr/d，黑暗8?hr/d進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行抗性芽的篩選；切下所得抗性芽轉(zhuǎn)入壯苗選擇培養(yǎng)基，在28℃的培養(yǎng)溫度下按照光照16?hr/d，黑暗8hr/d進(jìn)行生根培養(yǎng)，即得到所述過(guò)表達(dá)黃酮醇的植株。