[發明專利]一種耐熱性納豆激酶重組基因工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202210507662.2
• 申請日: 2022-05-11
• 公開（公告）號: CN114806990B
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 劉宏生;于曉淼;趙允章;趙健;馮華煒
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N9/56;C12N15/57;C07K1/14;C12R1/19
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

本發明公開一種耐熱性納豆激酶重組基因工程菌及其構建方法和應用。基于模擬計算方法篩選到了納豆激酶蛋白Y256P突變位點，構建含有突變位點的PGEX?6P?NK_Y256P重組質粒載體，并將其轉入大腸桿菌BL21中進行表達，獲得重組基因工程菌LNUB571。本發明成功構建耐熱性納豆激酶重組基因工程菌，納豆激酶熱穩定性顯著提高，為今后納豆激酶工業化生產及大規模應用奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一株耐熱性納豆激酶重組基因工程菌的構建和應用。

本發明中所稱的耐熱性納豆激酶重組基因工程菌為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)LNUB571，該菌株已于2021年12月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC?No.24107。

背景技術

納豆是一種傳統的日本食品，由大豆和枯草芽孢桿菌發酵而成，納豆激酶(Nattokinase，NK)是一種由275個氨基酸組成的絲氨酸蛋白酶。納豆激酶除具有極高的溶栓活性作用外，對心腦血管疾病中：高血液黏度、高血壓、高血脂、高膽固醇癥狀，改善血液循環狀況方面有良好效果，有望于在心腦血管疾病的預防和治療中起到積極地作用，未來極有可能成為治療血栓病的特效藥。

與市面上其他治療血栓的藥物相比，納豆激酶具有安全、高效、價廉、易得等優點，應用前景十分廣闊。然而，耐熱性差、純化工作困難等問題的存在，導致納豆激酶的產量很低，極大地限制了納豆激酶的批量加工生產。鑒于納豆激酶功效及發展前景，通過對納豆激酶進行基因改造，構建一株耐熱性強的納豆激酶重組基因工程菌株，對于提高納豆激酶的產量，促進納豆激酶的產業化具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是構建一株耐熱性納豆激酶重組基因工程菌。

本發明采用的技術方案是：一種耐熱性納豆激酶重組基因工程菌，所述耐熱性納豆激酶重組基因工程菌為大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)LNUB571，保藏編號為：CGMCCNo.24107。

一種耐熱性納豆激酶重組基因工程菌的構建方法，包括如下步驟：

1)以枯草芽孢桿菌DNA為模板，以Primer?1和Primer?2為引物，通過PCR反應，獲得兩端添加酶切位點EcoR?I和Xho?I的納豆激酶前導肽-成熟肽基因片段NKt；

Primer?1：CCGCTCGAGTCTAGAAATTGAGCAGCAGC

Primer?2：GCGGAATTCGCTGGTAAGTCCTCCACCG

進一步的，PCR反應的條件為：

PCR反應條件：98℃預變性2min；98℃10s，55℃30s，72℃30s，72℃延伸7min，25cycles；4℃10min。

進一步的，所述基因片段NKt的DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2)構建重組表達載體PGEX-6P-NK_Y256P：以基因片段NKt?DNA為模板，以Primer?3和Primer?4，Primer?5和Primer?6為引物，通過重疊延伸PCR反應，獲得NK_Y256P基因片段；將NK_Y256P基因片段和PGEX-6P-1載體進行雙酶切連接，獲得重組表達載體PGEX-6P-NK_Y256P；

Primer?3：CCGCTCGAGTCTAGAAATTGAGCAGCAGC