[發明專利]一種耐熱性納豆激酶重組基因工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202210507662.2
• 申請日: 2022-05-11
• 公開（公告）號: CN114806990B
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 劉宏生;于曉淼;趙允章;趙健;馮華煒
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N9/56;C12N15/57;C07K1/14;C12R1/19
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

1.一種耐熱性納豆激酶重組基因工程菌，其特征在于，所述耐熱性納豆激酶重組基因工程菌為大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)LNUB571，保藏編號為：CGMCC?No.24107。

2.一種耐熱性納豆激酶重組基因工程菌的構建方法，其特征在于，構建方法包括如下步驟：

1)以枯草芽孢桿菌DNA為模板，以Primer?1和Primer?2為引物，通過PCR反應，獲得兩端添加酶切位點EcoR?I和Xho?I的納豆激酶前導肽-成熟肽基因片段NKt；

Primer?1：CCGCTCGAGTCTAGAAATTGAGCAGCAGC

Primer?2：GCGGAATTCGCTGGTAAGTCCTCCACCG

2)構建重組表達載體PGEX-6P-NK_Y256P：以基因片段NKt?DNA為模板，以Primer?3和Primer?4，Primer?5和Primer?6為引物，通過重疊延伸PCR反應，獲得突變的NK_Y256P基因片段；將突變的NK_Y256P基因片段和PGEX-6P-1載體進行雙酶切連接，獲得重組表達載體PGEX-6P-NK_Y256P；

Primer?3：CCGCTCGAGTCTAGAAATTGAGCAGCAGC

Primer?4：TAGAAGGAGTTACCCAGTGGGGTTGCAGTGGATTCCAATCT

Primer?5：CCACTGGGTAACTCCTTCTACTACGGTAAGGGTTTGATCAA

Primer?6：GCGGAATTCGCTGGTAAGTCCTCCACCG

3)轉化：將重組表達載體PGEX-6P-NK_Y256P轉化到大腸桿菌BL21中，獲得重組基因工程菌，為耐熱性納豆激酶重組基因工程菌。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟1)中，PCR反應的條件為：

PCR反應體系25μL：

PCR反應條件：98℃預變性2min；98℃10s，55℃30s，72℃30s，72℃延伸7min，25cycles；4℃10min。

4.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟2)中，重疊延伸PCR反應的條件為：

PCR上游反應體系25μL：

?

PCR下游反應體系25μL：

PCR反應體系25μL：

PCR反應條件：98℃預變性2min；98℃10s，55℃30s，72℃30s，72℃延伸7min，25cycles；4℃10min。

5.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟1)中，所述基因片段NKt的DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示。

6.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟2)中，所述NK_Y256P基因片段的DNA序列如SEQ?ID?NO.2所示。

7.權利要求1所述的一種耐熱性納豆激酶重組基因工程菌在表達納豆激酶中的應用。

8.權利要求1所述的一種耐熱性納豆激酶重組基因工程菌在制備納豆激酶蛋白中的應用。