[發明專利]靈芝多糖的發酵提取方法、靈芝多糖組合物及其應用

在審

• 申請號: 202210506935.1
• 申請日: 2022-05-11
• 公開（公告）號: CN114672527A
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發明（設計）人: 吳建新;黃慶;柴娜
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;A61K8/73;A61Q19/08;A61Q19/00;C12R1/125;C12R1/865;C12R1/25
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司 32243
• 代理人: 姜夢翔

1.一種靈芝多糖的發酵提取方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：

①將發酵底物加10～20倍重量的無菌水，混合均勻，作為半固體發酵培養基，所述發酵底物為靈芝子實體初步研磨或機械破壁形成的絮狀粗粉或靈芝原料進一步破壁處理后形成的粘稠絮狀物；

②進行一次發酵純化處理，所述一次發酵純化處理過程包括：將活化后的枯草芽孢桿菌按接種至半固體發酵培養基中，在空氣通風條件下，30℃～37℃溫度下恒溫搖瓶發酵12～72h，抽濾獲取濾液，濾液離心取上清液，上清液濃縮凍干保存記為一次發酵靈芝粗提取物，培養基中的剩余藥渣高壓蒸汽滅菌終止發酵；對一次發酵靈芝粗提取物進行純化處理，獲得一次發酵純化多糖組合物；

③進行二次發酵純化，所述二次發酵純化處理過程包括：將活化后的釀酒酵母菌接種至培養基中，在空氣通風條件下，30℃～37℃下恒溫搖瓶發酵12～72h，抽濾獲取濾液，濾液離心取上清液，上清液濃縮凍干保存記為二次發酵靈芝粗提取物；藥渣高壓蒸汽滅菌終止發酵；二次發酵靈芝粗提取物進行純化處理，獲得二次發酵純化多糖組合物；

④進行三次發酵純化，所述三次發酵純化處理過程包括：將活化后的乳酸菌屬的菌株接種至培養基中，在空氣通風條件下，30～37℃溫度下靜置發酵培養12～72h，抽濾獲取濾液，濾液離心取上清液，上清液濃縮凍干保存記為三次發酵靈芝粗提取物；

其中，所述步驟②、步驟③和步驟④中的純化處理過程均包括：脫脂、脫蛋白和醇沉的步驟。

2.根據權利要求1所述的一種靈芝多糖的發酵提取方法，其特征在于：步驟②和步驟③中，所述搖瓶發酵的轉速均為200r/min。

3.根據權利要求1所述的一種靈芝多糖的發酵提取方法，其特征在于：步驟②、步驟③和步驟④的純化處理過程中，所述脫脂過程包括：加95％乙醇，渦旋3min，10000r/min離心5min，取沉淀重復離心3～5次，棄上清液。

4.根據權利要求1所述的一種靈芝多糖的發酵提取方法，其特征在于：步驟②、步驟③和步驟④的純化處理過程中，所述脫蛋白過程包括：一步沉淀揮干，加水和Sevag試劑，每1mL水配置250μL Sevag試劑，渦旋10min，10000r/min離心2min，取水相加Sevag試劑重復操作5～8次，直至無沉淀出現。

5.根據權利要求1所述的一種靈芝多糖的發酵提取方法，其特征在于：步驟②、步驟③和步驟④的純化處理過程中，所述醇沉過程包括：二步水相揮干有機溶劑，每200μL水相加800μL無水乙醇，4℃條件下放置12～16h，12000r/min離心10min，棄上清液，沉淀50℃烘干。

6.一種靈芝多糖組合物，其特征在于，所述組合物為權利要求1所述的提取方法中獲得的一次發酵純化多糖組合物、二次發酵純化多糖組合物或三次發酵純化多糖組合物中的任意一種或其中兩種的任意組合或三種的組合。

7.根據權利要求1所述的一種靈芝多糖的發酵提取方法，其特征在于：所述發酵底物為靈芝原料破壁粘稠絮狀物，在所述配置成半固體發酵培養基之前，還包括以下操作步驟：對所述粘稠絮狀物進行超聲水提處理，初步提取濾液，濾液濃縮凍干保存記為初始靈芝粗提取物；對初始靈芝粗提取物進行純化獲得初始純化多糖組合物。

8.根據權利要求7所述的一種靈芝多糖的發酵提取方法，其特征在于：所述超聲水提處理過程包括：將所述粘稠絮狀物按料液比1:20加水，在破壁機中破壁攪拌4min，轉移至超聲機中，60℃溫度條件下，360W超聲60min，后提取濾液，循環所述破壁攪拌和超聲處理至少三次后，合并濾液，旋轉蒸發儀濃縮至約1/10，凍干后保存，剩余的殘渣作為發酵底物進行后續發酵。

9.一種靈芝多糖組合物，其特征在于，所述組合物為權利要求7所述的提取方法獲得的初始純化多糖組合物、一次發酵純化多糖組合物、二次發酵純化多糖組合物或三次發酵純化多糖組合物中的任意一種或其中兩種的任意組合或三種的任意組合或四種的組合。

10.一種如權利要求6或9所述的靈芝多糖組合物在制備抗氧化、抗糖化、抗衰老和/或保濕方面的皮膚外用劑中的用途。