[發(fā)明專利]一種穩(wěn)定過表達SRSF3的RAW 264.7細(xì)胞系、其制備方法及應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210503386.2
• 申請日: 2022-05-10
• 公開（公告）號: CN115927190A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李雅林;毛雙雙;劉凱;李明亮;何浩;劉有旺;康莉;封勇;王琪
• 申請（專利權(quán)）人: 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/12;A61K35/15;A61K38/17;A61P29/00;A61P35/00
• 代理公司: 濟南圣達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 呂薇

本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定過表達SRSF3的RAW?264.7細(xì)胞系、其制備方法及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明構(gòu)建過表達SRSF3的Lenti?Flag?hyg?SRSF3質(zhì)粒，與psPAX2和pMD2.G包裝載體構(gòu)成三質(zhì)粒表達系統(tǒng)，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集慢病毒，再以慢病毒轉(zhuǎn)染RAW?264.7巨噬細(xì)胞，獲得過表達SRSF3基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。用抗Flag的熒光抗體檢測過表達SRSF3基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，LPS誘導(dǎo)炎癥模型，經(jīng)Western?Blot、qPCR檢測，過表達SRSF3的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株可以通過抑制自噬，降低炎癥因子的表達水平，具有抑制炎癥的開發(fā)和應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種穩(wěn)定過表達SRSF3的RAW264.7細(xì)胞系、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

SRSF3基因富含絲氨酸/精氨酸剪接因子3(serine/arginine-rich?splicingfactor3，SRSF3)，是一種富含絲氨酸/精氨酸(S/R)重復(fù)序列的蛋白質(zhì)，它們具有相似的結(jié)構(gòu)域，即位于氨基末端(N末端)的RNA識別結(jié)構(gòu)域(RNA?recognition?motif，RRM結(jié)構(gòu)域)和位于羧基末端(C末端)含有高度磷酸化的絲氨酸和精氨酸重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)域(arginine/serine-rich?domain，RS結(jié)構(gòu)域)。在RNA剪接體的組裝和選擇性剪接的調(diào)控過程中具有重要的作用。通過選擇性剪接影響細(xì)胞生物學(xué)的各個方面，包括增殖、分化、細(xì)胞周期、代謝、凋亡、遷移、侵襲和血管生成等。

人們希望能在哺乳動物細(xì)胞中表達目的基因，目前采用的有三大類病毒表達載體：腺病毒表達載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體和慢病毒表達載體，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期細(xì)胞，而且容量有限，腺病毒一般不能整合到染色體上，只能進行瞬時感染。慢病毒載體(Lentiviral?vector)是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，區(qū)別于一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有干擾能力。慢病毒還具有可以容納外源性基因片段大，并且可以長期表達等顯著優(yōu)點。

RAW?264.7細(xì)胞是源自BALB/c小鼠Abelson鼠科白血病病毒誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞。細(xì)胞體積小，用脂質(zhì)體瞬轉(zhuǎn)SRSF3轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的DNA半衰期短，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞往往會受到損害。RAW?264.7細(xì)胞本身具有很強的貼壁性和偽足產(chǎn)生性，以往研究表明它被siRNA轉(zhuǎn)染的效率低下，目前關(guān)于慢病毒載體轉(zhuǎn)染RAW?264.7細(xì)胞的相關(guān)報道較少，如何高效、可靠地轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞仍需進一步研究。

另外，不同的轉(zhuǎn)染基因，對于巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果不同，同時對巨噬細(xì)胞的功能也會產(chǎn)生不同的影響。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的SRSF3轉(zhuǎn)染效果差、轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的DNA半衰期短，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞受到損害的問題，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定過表達SRSF3的RAW?264.7細(xì)胞系及應(yīng)用，具有較高的轉(zhuǎn)染效率。

作為本發(fā)明的第一個方面，在于提供一種穩(wěn)定過表達SRSF3的RAW?264.7細(xì)胞系，通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染方法獲得，SRSF3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

所述穩(wěn)定過表達SRSF3的RAW?264.7細(xì)胞系具有抑制炎癥的作用。

作為本發(fā)明的第二個方面，在于提供這種穩(wěn)定過表達SRSF3的RAW?264.7細(xì)胞系的制備方法，包括如下步驟：

步驟一、構(gòu)建過表達SRSF3的Lenti-Flag-hyg-SRSF3質(zhì)粒；

步驟二、將步驟一構(gòu)建的Lenti-Flag-hyg-SRSF3質(zhì)粒與psPAX2和pMD2.G包裝載體構(gòu)成三質(zhì)粒表達系統(tǒng)，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集慢病毒并濃縮；

步驟三、以慢病毒轉(zhuǎn)染RAW?264.7巨噬細(xì)胞，獲得過表達SRSF3基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。