[發明專利]一種用于檢疫鑒定黃瓜綠斑駁花葉病毒的種子粉基體標準樣品制備方法

在審

• 申請號: 202210492051.5
• 申請日: 2022-05-07
• 公開（公告）號: CN114891914A
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發明（設計）人: 曹際娟;尹新穎;徐藝玲;劉奕鑾;張一;陸忠婷;閆爽;馬超
• 申請（專利權）人: 大連民族大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;G01N33/68
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 胡景波

本發明屬于植物檢疫鑒定領域，公開了一種用于檢疫鑒定黃瓜綠斑駁花葉病毒的種子粉基體標準樣品制備方法，先后經過種子批中感染的CGMMV野生株鑒定、確定原料重量、低溫研磨、篩分處理、攪拌混勻、分裝儲存及性能評價、溯源性描述及聯合定值，得到的CGMMV種子粉基體標準樣品的均勻性、穩定性及不確定度適中，在一定的時間內CGMMV特性量值不會隨著時間的變化而產生變化，樣品的均勻性和穩定性符合國家標準樣品的要求，填補了我國目前沒有該類種子粉基體標準樣品的空白，可以用于種子及制品中CGMMV檢疫鑒定方法驗證、檢測試劑盒評價、實驗室檢測過程質量控制、實驗室能力驗證和比對、人員能力考核，提高植物檢疫鑒定實驗室的檢疫檢測水平。

技術領域

本發明屬于植物檢疫鑒定領域，本發明涉及一種用于植物檢疫鑒定實驗室質量控制的黃瓜綠斑駁花葉病毒種子粉基體標準樣品制備方法，具體為一種植物檢疫鑒定限制的用于檢測種子及其制品植物病害的黃瓜綠斑駁花葉病毒種子粉基體標準樣品的制備方法。

背景技術

黃瓜綠斑駁花葉病毒病(CGMMV)是一種毀滅性的植物病害，主要危害黃瓜、西葫蘆、西瓜和甜瓜等瓜類作物，導致葉片呈現斑駁、果實變形和植株發育遲緩，產量顯著下降，嚴重威脅著瓜類作物的生產。2003年我國首次在廣西觀賞南瓜上發現該病毒，近幾年又陸續在廣東、湖南、江蘇、海南、遼寧等地發現。該病毒已被許多國家和地區列為重點關注的檢疫性有害生物。CGMMV的主要傳播途徑是種子傳播以及植物花粉。瓜類作物是世界上最重要的食用植物之一，也是最重要的園藝植物之一，更是農民增收的重要產業。從CGMMV傳播狀況來看，實施作物田間監測，極早發現、及時阻斷感染源，對于瓜類作物的健康培育極其重要。

CGMMV是瓜類種子檢疫鑒定最常見的檢測項目。按照我國現有執行的GB/T36781-2018《瓜類種傳病毒檢疫鑒定方法》，采用ELISA方法檢測蛋白、RT-PCR方法檢測核酸進行CGMMV檢疫鑒定。在檢疫鑒定中需要使用CGMMV標準樣品。標準樣品是一批確定具有足夠均勻、足夠穩定的特性值的物質，為確保該批樣品在不同空間中進行量值傳遞，該批標準樣品提供的量值必須是均勻一致的。標準樣品作為檢測行業中的“量具”，在校準測量儀器和裝置、評價分析方法、檢測特性值和考核分析人員的操作技術水平，以及在實驗室檢測過程中的質量控制等領域起著不可或缺的作用。目前國內外尚沒有CGMMV種子粉基體標準樣品，由于CGMMV寄生在種子等植物上，健康種子不攜帶CGMMV，而被感染的每粒種子則帶毒量不同，CGMMV分布不均勻，導致不同的樣品會在不同實驗室、不同人員等方面造成極大的檢測誤差。以上原因使得制備難度很大導致國內外目前還缺乏用于檢疫鑒定量值保障的CGMMV種子粉基體標準樣品，對我國瓜類作物中CGMMV的檢疫鑒定帶來了不便。

現有技術中存在檢測葫蘆科種子攜帶CGMMV的樣品制備方法，比如有CN105177187A專利申請公開了“檢測葫蘆科種子攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒的樣品制備方法及用途”，涉及一種攜帶CGMMV的葫蘆科種子樣品的處理，以及血清學和分子生物學檢測方法及應用。包括以下步驟：種子樣品種仁和種殼的分離，剝除種仁部分，收集剩余的種殼；樣品的研磨是以1粒種子分離的種殼作為1個樣品放入離心管中，經液氮冷凍1分鐘后，然后放入全自動樣品快速研磨儀中研磨，制備了該1粒種子種殼的粉末狀樣品。然而，該方法針對1粒種子的種殼進行粉碎，僅適用于對該粒種子進行檢疫鑒定。每粒種子的帶毒量不同，以1粒種子的種殼來制備粉末狀樣品，對于無法保證每粒種子都攜帶CGMMV的樣品而言，這種制備方法既費時費力，又無法保障大批量種子中CGMMV的分布均勻性，不適合用于制備大批量的標準樣品。此外，更為重要的是，上述產品目標不是提供用于各類實驗室檢疫鑒定質量控制用的標準樣品，且僅1粒種子種殼的粉末狀樣品，無法開展大批量標準樣品中特性量值的均勻性和穩定性評價，不符合國家標準樣品的制備要求，因此，還需要開發用于檢疫鑒定種子及其制品植物病害的CGMMV種子粉基體標準樣品的制備方法。

發明內容