[發明專利]一種具有寬底物譜的將羧酸專一轉化為手性β-羥基羧酸的人工酶

有效

• 申請號: 202210491196.3
• 申請日: 2022-05-07
• 公開（公告）號: CN114921427B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發明（設計）人: 王喜慶;張騰飛;章昆
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/10;C12P7/42;C12P17/04;C12P17/12;C12P7/6409;C12P7/6427
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

本發明公開了一種將羧酸轉化為β?羥基羧酸的人工酶，屬于蛋白質工程領域。本發明羧酸β?羥基化酶P450_BSβ突變體是由野生型羧酸羥基化酶P450_BSβ的氨基酸序列在第78位、85位和290位突變得到的。羧酸β?羥基化酶P450_BSβ?L78I/Q85H/G290I是在脂肪酸β?羥基化酶P450_BSβ?L78A/Q85A/V170I/G290I的基礎上改進后得到的產率更高、底物范圍更廣的人工酶。本發明構建的人工酶催化的底物范圍擴展為C6?C20鏈長的天然直鏈飽和脂肪酸、天然不飽和脂肪酸以及非天然羧酸。本發明可將這些底物一步轉化為相應的(R)?β?羥基羧酸。

技術領域

本發明涉及一種利用過氧化氫作為氧化劑將羧酸轉化為β-羥基羧酸的人工酶，屬于蛋白質工程領域。

背景技術

β-羥基羧酸是一類重要的化合物。含有10-14個碳原子的β-羥基羧酸(C10-C14)具有天然的除草和抗真菌特性。當與氨基酸或碳水化合物結合時，它們可以創造出更多具有結構復雜性和生物學意義的天然產物，如抗生素、具有殺蟲效果和免疫調節活性的有機化合物。β-羥基羧酸還可以作為合成二醇、β-氨基酸、β-內酯、β-內酰胺、雙環庚酮和多羥基烷酸酯的合成前體，它們在天然產物合成、藥物發現和生物材料中有著更多的應用。因此，β-羥基羧酸的制備受到了廣泛的關注。

常用的合成β-羥基羧酸的化學方法包括線性醛的不對稱aldol反應，Reformatsky反應和β-酮基羧酸的不對稱氫化反應，通常需要過渡金屬和復雜的催化配體或化學計量的手性助劑。酮還原酶還可以不對稱地還原β-酮基羧酸，提供酶促途徑獲得手性β-羥基羧酸。

在前期的研究中，通過工程化P450_BSβ變體(P450_BSβ-L78A/Q85A/V170I/G290I)對生物可用脂肪酸進行β-C-H氧化官能化。盡管這是一種直接、分步經濟且生態友好的反應，具有優異的區域選擇性和對映選擇性，但可接受的底物僅限于鏈長超過10個碳原子的脂肪酸，妨礙其在β-羧酸合成中的廣泛應用。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有的技術缺陷，提供一種利用過氧化氫作為氧化劑將羧酸轉化為β-羥基羧酸的人工酶，制備的羧酸β-羥基酶P450_BSβ突變體催化產生β-羥基羧酸，將底物范圍擴大至C₆-C₂₀鏈長的天然直鏈飽和脂肪酸、油酸、亞油酸以及帶有不同官能團的非天然羧酸。該發明具有反應活性高、高區域和對映體選擇性、底物范圍廣、體系簡單、合成效率高和成本低廉等優勢。

本發明通過對P450_BSβ羥基化酶的定向進化實現了對羧酸的未活化β位C-H鍵的高度區域和對映選擇性地氧化。獲得的P450_BSβ羥基化酶突變體能夠直接使用廉價的過氧化氫作為氧化劑，以C6-C20鏈長的天然直鏈飽和脂肪酸、天然不飽和脂肪酸(油酸或亞油酸)以及含有烯烴、炔烴、溴、胺、腈、酯、二羥基、環戊基、呋喃、吡咯、苯甲氧基(鄰位、間位、對位)、氟苯基、氯苯基、苯甲酰甲氧基等不同官能團的非天然羧酸為底物生成R型手性的β-羥基羧酸。

為解決上述技術問題，本發明提供一種羧酸β-羥基化酶P450_BSβ突變體，含有如SEQID?NO:1所示的氨基酸序列。

本發明還提供編碼上述羧酸β-羥基化酶P450_BSβ突變體的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

本發明還提供包含上述羧酸β-羥基化酶P450_BSβ突變體的核苷酸序列的載體。

本發明還提供表達上述羧酸β-羥基化酶P450_BSβ突變體的基因工程菌。