[發(fā)明專利]一種具有寬底物譜的將羧酸專一轉(zhuǎn)化為手性β-羥基羧酸的人工酶

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210491196.3
• 申請日: 2022-05-07
• 公開（公告）號: CN114921427B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王喜慶;張騰飛;章昆
• 申請（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/10;C12P7/42;C12P17/04;C12P17/12;C12P7/6409;C12P7/6427
• 代理公司: 南京縱橫知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

1.?一種羧酸β-羥基化酶P450BSβ突變體，其特征在于，所述羧酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

2.?一種核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列編碼如權(quán)利要求1所述羧酸β-羥基化酶P450BSβ突變體，所述核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

3.?如權(quán)利要求1所述羧酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的制備方法，其特征在于，將野生型的P450BSβ第78位的亮氨酸突變成異亮氨酸，將第85位的谷氨酰胺突變組氨酸，將第290位的甘氨酸突變成異亮氨酸，所述野生型的P450BSβ序列如SEQ?ID?NO:3所示。

4.如權(quán)利要求1所述羧酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

構(gòu)建表達(dá)野生型羧酸羥基化酶P450BSβ的質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中；

通過三輪定點(diǎn)飽和突變，構(gòu)建飽和突變庫，篩選到表達(dá)能夠高度區(qū)域選擇性和對映體選擇性氧化羧酸β位C-H基團(tuán)的P450BSβ突變體的突變質(zhì)粒；

羧酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的表達(dá)及純化。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的羧酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的制備方法，其特征在于，羧酸β-羥基化酶P450BSβ突變體的表達(dá)及純化包括如下步驟：

將篩選到的突變質(zhì)粒在LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，加入TB液體培養(yǎng)基擴(kuò)培，于對數(shù)生長期內(nèi)加入血紅素前體δ-氨基乙酰丙酸和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收菌；

用緩沖液將得到的菌體重懸，通過超聲破碎裂解細(xì)胞，離心，獲得上清液；

將上清液加入鎳離子親和柱內(nèi)，使帶有His標(biāo)簽的目的蛋白與鎳離子結(jié)合，除去雜蛋白，洗脫目的蛋白，得到羧酸β-羥基化酶P450BSβ突變體。

6.一種β-羥基羧酸的制備方法，其特征在于，以C6-C20鏈長的天然直鏈飽和脂肪酸、天然不飽和脂肪酸以及非天然羧酸作為底物，將過氧化氫作為氧化劑，以權(quán)利要求1所述的羧酸β-羥基化酶P450BSβ突變體為催化劑進(jìn)行催化反應(yīng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的β-羥基羧酸的制備方法，其特征在于，所述天然不飽和脂肪酸為油酸或亞油酸；所述非天然羧酸含有烯烴、炔烴、溴、胺、腈、酯、二羥基、環(huán)戊基、呋喃、吡咯、苯甲氧基、氟苯基、氯苯基、苯甲酰甲氧基的一種或多種官能團(tuán)。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的β-羥基羧酸的制備方法，其特征在于，所述β-羥基羧酸為R型β-羥基羧酸。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的β-羥基羧酸的制備方法，其特征在于，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系為水相體系。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羧酸β-羥基化酶P450BSβ突變體在制備β-羥基羧酸的應(yīng)用。