[發明專利]一種調控/降低乙酰輔酶A支路代謝高效合成7-脫氫膽固醇的方法

在審

• 申請號: 202210488049.0
• 申請日: 2022-05-06
• 公開（公告）號: CN115044603A
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發明（設計）人: 范超;劉龍;吳文忠;陳堅;呂雪芹;修翔;齊佳琨;洪皓
• 申請（專利權）人: 大連醫諾生物股份有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/90;C12N15/54;C12N15/55;C12N15/53;C12N15/61;C12P33/02;C12R1/865
• 代理公司: 大連格智知識產權代理有限公司 21238
• 代理人: 劉曉琴

1.一種調控/降低乙酰輔酶A支路代謝高效合成7-脫氫膽固醇的方法，其特征在于，包括利用一類有關乙酰輔酶A分解代謝的關鍵基因，在工程菌內進行基因重組，以降低乙酰輔酶A分解；從而增強7-脫氫膽固醇合成；所述的在7-DHC合成中的一類有關乙酰輔酶A分解代謝的關鍵基因包括：

核苷酸序列如SEQ ID No.41所述的編碼天冬氨酸轉氨酶的aat1基因、核苷酸序列如SEQ ID No.42所述的磷酸甘油酸途徑的磷酸絲氨酸磷酸酶ser2基因、核苷酸序列如SEQ IDNo.44所述的NADP(+)依賴性谷氨酸脫氫酶gdh1基因、核苷酸序列如SEQ ID No.43所述的NADP(+)依賴性谷氨酸脫氫酶gdh3基因、核苷酸序列如SEQ ID No.45所述的CDP-二酰基甘油-絲氨酸O-磷脂酰轉移酶cho1基因。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用有關乙酰輔酶A分解代謝的關鍵基因的方法是敲除這些基因。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法不僅包括利用上文所述的一類有關乙酰輔酶A分解代謝的關鍵基因，還包括利用增加乙酰輔酶A合成的基因，在工程菌內進行基因重組。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的增加乙酰輔酶A合成的基因包括：核苷酸序列如SEQ ID No.40所述的線粒體蘋果酸脫氫酶mae1基因、乙醇脫氫酶II adh2基因或D-乳酸脫氫酶dld1基因。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用有關乙酰輔酶A合成的關鍵基因的方法是對增加乙酰輔酶A合成的基因進行增強表達；所述的增強表達的途徑包括使用下述組成型啟動子：P_TDH3、P_TEF1、P_PGK1、P_ENO2、P_TPL1，或者使用下述誘導型啟動子P_GAL1、P_GAL10、P_GAL7。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的工程菌選自釀酒酵母S288C、釀酒酵母BY4742、釀酒酵母Y187、畢赤酵母x-33或熱帶假絲酵母1798。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，通過過表達和敲除相關基因，控制酵母中整體的輔因子NADH/NAD+的比例范圍是0.3-0.8。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，以原始釀酒酵母S288C為出發菌株，導入7-DHC合成模塊，同時使用啟動子P_TDH3控制核苷酸序列如SEQ ID No.40所述的線粒體蘋果酸脫氫酶mae1的表達，接下來使用Cas9分別對核苷酸序列如SEQ ID No.41所述的編碼天冬氨酸轉氨酶的aat1、核苷酸序列如SEQ ID No.44所述的NADP(+)依賴性谷氨酸脫氫酶gdh1、核苷酸序列如SEQ ID No.43所述的NADP(+)依賴性谷氨酸脫氫酶gdh3和核苷酸序列如SEQ IDNo.45所述的CDP-二酰基甘油-絲氨酸O-磷脂酰轉移酶cho1基因進行敲除。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的7-DHC合成模塊是包括核苷酸序列如SEQ ID No.46所述的經密碼子優化的來源于雞的DHCR24還原酶基因，內源C-8甾醇異構酶ERG2，內源C-5甾醇去飽和酶ERG3。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，以原始的釀酒酵母S288C為出發菌株，使用啟動子P_TDH3控制核苷酸序列如SEQ ID No.40所述的線粒體蘋果酸脫氫酶mae1的表達，接下來使用Cas9分別對核苷酸序列如SEQ ID No.41所述的編碼天冬氨酸轉氨酶的aat1、核苷酸序列如SEQ ID No.44所述的NADP(+)依賴性谷氨酸脫氫酶gdh1、核苷酸序列如SEQ IDNo.43所述的gdh3和核苷酸序列如SEQ ID No.45所述的CDP-二酰基甘油-絲氨酸O-磷脂酰轉移酶cho1基因進行敲除。