[發(fā)明專利]一種調(diào)控/降低乙酰輔酶A支路代謝高效合成7-脫氫膽固醇的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210488049.0
• 申請日: 2022-05-06
• 公開（公告）號: CN115044603A
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 范超;劉龍;吳文忠;陳堅;呂雪芹;修翔;齊佳琨;洪皓
• 申請（專利權(quán)）人: 大連醫(yī)諾生物股份有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/90;C12N15/54;C12N15/55;C12N15/53;C12N15/61;C12P33/02;C12R1/865
• 代理公司: 大連格智知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21238
• 代理人: 劉曉琴

本發(fā)明公開了一種調(diào)控/降低乙酰輔酶A支路代謝高效合成7?脫氫膽固醇的方法，其利用一類有關(guān)乙酰輔酶A分解代謝的關(guān)鍵基因降低乙酰輔酶A分解，同時平衡細胞內(nèi)還原力，進而高效合成7?脫氫膽固醇的方法。該方法克服了傳統(tǒng)的只通過增強乙酰輔酶A用于提升7?脫氫膽固醇的技術(shù)，而是提供有關(guān)7?脫氫膽固醇合成相關(guān)的基因，并通過對這些基因的過表達和敲除，進而增強乙酰輔酶A的合成，同時降低乙酰輔酶A消耗，實施例證明其最終7?DHC的產(chǎn)量達到269mg/L；比SC001的7?DHC產(chǎn)量提高了25倍；達到增強7?脫氫膽固醇在微生物中合成的目的。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種，特別涉及一種調(diào)控/降低乙酰輔酶A支路代謝高效合成7-脫氫膽固醇的方法。

背景技術(shù)

維生素D₃(Cholecalciferol,VD₃)是一種人體必需的脂溶性維生素，調(diào)節(jié)人體中的鈣、磷代謝，因此，常作為于治療佝僂病、軟骨病和維持鈣穩(wěn)態(tài)等方面的藥物。一般成年健康的人類可以通過將體內(nèi)攝入的膽固醇轉(zhuǎn)化為VD₃，而不需要額外補充VD₃。但是隨著全球老齡化人口的增加，老年人戶外活動減少，并且隨著年紀的增長，人體吸收能力的降低和內(nèi)臟功能的退化，便會出現(xiàn)因VD₃缺乏而導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松等疾病。不光是老年人需要補充VD₃，嬰幼兒由于剛出生吸收能力還未完全成熟，并急需供應(yīng)身體快速生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，因此，同樣需要額外補充VD₃。7-脫氫膽固醇(7-dehydrocholestero，7-DHC)是合成VD₃的重要前體物質(zhì)，它經(jīng)過紫外照射轉(zhuǎn)化為VD₃。7-DHC是一種重要的甾體激素類藥物中間體，不光能合成VD3，同時也是合成雄甾烯二酮(4AD)等甾體藥物的中間體。為了滿足全球VD₃的巨大市場，工業(yè)上將獲得的7-DHC，在230-300nm的高壓汞燈照射下轉(zhuǎn)化為VD₃，因此，生產(chǎn)VD3的核心問題在于7-DHC的合成。

傳統(tǒng)的工業(yè)化7-DHC的制備方法主要有提取法(魚肝油為原料)和化學(xué)合成法，因容易受到過敏反應(yīng)的影響，提取法目前已逐步被化學(xué)合成法所替代。化學(xué)合成法是以羊毛脂膽固醇為原料，經(jīng)過氧化、溴化、消除和水解反應(yīng)合成7-DHC。化學(xué)合成法中底物羊毛脂膽固醇的質(zhì)量直接決定了最終產(chǎn)物7-DHC的質(zhì)量，因此，為了獲得高品質(zhì)的羊毛脂膽固醇，通常也需要進行酸化等處理。化學(xué)合成的方法雖然是目前工業(yè)化生產(chǎn)中常用的方法，但是其能耗高，反應(yīng)條件苛刻且后處理繁瑣，并對環(huán)境污染嚴重。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)7-DHC具有綠色可持續(xù)的優(yōu)勢，并且微生物(如釀酒酵母)是一種安全可靠，具有巨大工業(yè)化應(yīng)用潛力的微生物，是生產(chǎn)7-DHC和VD₃優(yōu)秀的底盤細胞。

7-DHC的微生物合成主要集中在已知合成路徑中基因的增強和分支路徑的阻斷，但所需強化的基因同樣也適合生產(chǎn)其他產(chǎn)物。利用微生物進行7-DHC的生產(chǎn)時，強化和阻斷的基因雖然對合成目標產(chǎn)物具有一定的效果，但是由于7-DHC的合成涉及多個合成路徑，往往會造成代謝通量失衡，給生產(chǎn)菌株帶來負面影響。VD₃的微生物合成主要集中于菌株的篩選方面，但是菌株的篩選費時費力，不僅要確定高效的篩選方法，還需要花費大量金錢進行大規(guī)模后期篩選與發(fā)酵檢測，才能獲得VD₃產(chǎn)量極低的菌株。如中國專利CN103275997A、美國專利US2007/0204059A1、中國專利CN107075551B、中國專利CN104988168A。